Purification et profilage de microARN des exosomes dérivés du sang et de la culture des médias
Summary
La présence de microARN (miARN stables) dans exosomes a généré un immense intérêt comme un nouveau mode de communication intercellulaire, pour leur utilité potentielle en tant que biomarqueurs et comme une voie pour l'intervention thérapeutique. Ici, nous démontrons purification d'exosomes à partir de supports de sang et de culture, suivie par PCR quantitative pour identifier les miARN transportés.
Abstract
Stable miARN sont présents dans tous les liquides corporels et certains miARN qui circulent sont protégés de la dégradation par la séquestration dans de petites vésicules appelées exosomes. Les exosomes peuvent fusionner avec la membrane de plasma entraînant le transfert de l'ARN et des protéines de la cellule cible. Leurs fonctions biologiques sont la réponse immunitaire, la présentation de l'antigène, et de la communication intracellulaire. La livraison des miARN qui peuvent réguler l'expression des gènes dans les cellules receveuses par le sang a ouvert de nouvelles avenues d'intervention cible. En plus d'offrir une stratégie pour la livraison de médicaments ou d'agents thérapeutiques ARN, contenu exosomales peuvent servir de biomarqueurs qui peuvent aider dans le diagnostic, déterminer les options de traitement et le pronostic.
Ici, nous allons décrire la procédure d'analyse quantitative miARN et les ARN messagers (ARNm) à partir de exosomes sécrétés dans le sang et les milieux de culture de cellules. Exosomes purifiés seront caractérisés par western blot pour exosmarqueurs Omal et PCR pour ARNm d'intérêt. microscopie électronique à transmission (MET) et immunogold étiquetage seront utilisés pour valider la morphologie et de l'intégrité exosomal. L'ARN total seront purifiés à partir de ces exosomes afin de s'assurer que nous pouvons étudier à la fois l'ARNm et miRNA partir du même échantillon. Après validation intégrité de l'ARN par Bioanalyzer, nous allons effectuer un débit quantitative PCR en temps réel moyen (qPCR) pour identifier le miARN exosomal utilisant TaqMan Array basse densité (TLDA) des cartes et des études d'expression génique pour les transcriptions d'intérêt.
Ces protocoles peuvent être utilisés pour quantifier les changements dans les miARN exosomales chez les patients, les modèles de rongeurs et de milieux de culture de cellules avant et après l'intervention pharmacologique. Exosomales contenu varient en raison de la source d'origine et les conditions physiologiques de cellules qui sécrètent des exosomes. Ces variations peuvent donner un aperçu sur la façon dont les cellules et les systèmes à faire face au stress ou à des perturbations physiologiques. Nos données représentatives montrent variations dans miARN présents dans exosomes purifiés à partir du sang de souris, le sang humain et les milieux de culture de cellules humaines.
Ici, nous allons décrire la procédure d'analyse quantitative miARN et les ARN messagers (ARNm) à partir de exosomes sécrétés dans le sang et les milieux de culture de cellules. Exosomes purifiés seront caractérisés par western blot des marqueurs exosomales et PCR pour ARNm d'intérêt. microscopie électronique à transmission (MET) et immunogold étiquetage seront utilisés pour valider la morphologie et de l'intégrité exosomal. L'ARN total seront purifiés à partir de ces exosomes afin de s'assurer que nous pouvons étudier à la fois l'ARNm et miRNA partir du même échantillon. Après validation intégrité de l'ARN par Bioanalyzer, nous allons effectuer un débit quantitative PCR en temps réel moyen (qPCR) pour identifier le miARN exosomal utilisant TaqMan Array basse densité (TLDA) des cartes et des études d'expression génique pour les transcriptions d'intérêt.
Ces protocoles peuvent être utilisés pour quantifier les changements dans les miARN exosomales in patients, des modèles de rongeurs et de milieux de culture de cellules avant et après l'intervention pharmacologique. Exosomales contenu varient en raison de la source d'origine et les conditions physiologiques de cellules qui sécrètent des exosomes. Ces variations peuvent donner un aperçu sur la façon dont les cellules et les systèmes à faire face au stress ou à des perturbations physiologiques. Nos données représentatives montrent des variations dans les miARN présents dans exosomes purifiés à partir du sang de souris, le sang humain et les milieux de culture de cellules humaines
Introduction
MiARN non codantes court modulent l'expression des gènes en se liant à l'ARNm cible. Graine complémentarité de séquence de ~ 7 paires de bases permet miARN à se lier à l'ARNm cible résultant en l'inhibition de la traduction ou de diminution de la stabilité de l'ARNm, les deux pouvant entraîner une diminution de l'expression de la protéine cible 1. Recherche cours de la dernière décennie a prouvé sans équivoque un rôle fondamental pour miARN dans la médiation des fonctions cellulaires. Il ya également eu des efforts considérables dirigée vers dissection miRNA changements moléculaires qui sous-tendent les diverses maladies médiées par 2,3. En outre, l'identification récente de miARN stables dans les fluides corporels 4-6 ouvert la voie à leur utilisation en tant que nouveaux biomarqueurs qui se prêtent à un diagnostic clinique.
Un mode de transport des miARN dans les fluides corporels est via exosomes, petites vésicules qui transportent des ARNm, des protéines, des médiateurs lipidiques et microARN dans des cellules receveuses via circulant dans le sang systémiqueion 7-14. Il en résulte une modulation de l'expression des gènes dans les cellules receveuses et représente un nouveau mécanisme de communication cellulaire. Par exemple, les cellules peuvent moduler les processus immunitaires en sécrétant réglementaires et / ou exosomes absorbants contenant des biomolécules impliquées dans l'inflammation comme l'interleukine-1β (IL1β), facteur de nécrose tumorale α (TNF), facteur de croissance transformant β5 (TGFβ5), et miARN qui régulent ces gènes 13. Comme expression des miARN aberrante est une caractéristique commune à une variété de maladies humaines, ces molécules offrent de nouvelles possibilités passionnantes pour la découverte et la validation de nouvelles cibles thérapeutiques 2.
MiARN circulants sont présents dans tous les liquides corporels et il est connu que la composition des exosomes est différente basée sur les cellules de base dont ils ont été libérés. Ainsi, ils offrent une avenue pour étudier l'état physiologique des cellules et comment les cellules Alter signalisation mêmets en réponse au stress, y compris les maladies. L'étude des modifications dans la composition des exosomes peuvent donner un aperçu de la transduction de signal et d'enquêter sur leur utilité potentielle en tant que biomarqueurs ou des voies d'intervention thérapeutique.
Ici, nous allons démontrer la purification d'exosomes provenant de sources multiples basés sur les protocoles publiés. Ces exosomes seront utilisés pour l'isolation d'ARN suivie par qPCR à identifier et à mesurer les niveaux de miARN présents dans les exosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous montrons la quantification des miARN et ARNm des exosomes purifiés par centrifugation différentielle de médias de sang et de culture. Les exosomes sont diverses composantes dépend de leur origine et sont impliqués dans un certain nombre de fonctions biologiques, y compris la réponse immunitaire, la présentation de l'antigène, la communication intracellulaire, et le transfert de l'ARN et des protéines 9,11,12,19,20. Bien que la taille et la forme est un facteur détermi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par des fonds de Rita Allen subvention de la Fondation à Seena Ajit. Les auteurs tiennent à remercier Erika Balogh et le Dr Soumitra Ghoshroy de l'Université de Caroline du Sud Electron Microscopy Center pour l'utilisation de l'instrument, une assistance scientifique et technique.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
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