Purificazione e microRNA profiling di Exosomes derivati dal sangue e cultura dei media
Summary
La presenza di microRNA stabili (miRNA) in exosomes ha generato enorme interesse come un romanzo modalità di comunicazione intercellulare, per la loro potenziale utilità come biomarcatori e come via per l'intervento terapeutico. Qui mostriamo purificazione exosome dal sangue e cultura mediatica seguita da PCR quantitativa per identificare miRNA trasportati.
Abstract
MiRNA stabili sono presenti in tutti i fluidi corporei e di alcuni microRNA circolanti sono protetti dalla degradazione di sequestro in piccole vescicole chiamate exosomes. Exosomes possono fondersi con la membrana plasmatica con conseguente trasferimento di RNA e proteine per la cellula bersaglio. Le loro funzioni biologiche includono la risposta immunitaria, presentazione dell'antigene, e la comunicazione intracellulare. Consegna dei miRNA che possono regolare l'espressione genica nelle cellule riceventi attraverso il sangue ha aperto nuove strade per l'intervento di destinazione. Oltre ad offrire una strategia per la consegna di farmaci o RNA agenti terapeutici, contenuti exosomal possono servire come biomarcatori che possono aiutare nella diagnosi, determinare le opzioni di trattamento e la prognosi.
Qui descriveremo la procedura per analizzare quantitativamente miRNA e RNA messaggero (mRNA) da exosomes secreti nel sangue e nei mezzi di coltura cellulare. Exosomes purificati saranno caratterizzati mediante analisi Western Blot per exosmarcatori Omal e PCR per mRNA di interesse. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e l'etichettatura immunogold verranno utilizzati per convalidare la morfologia e l'integrità exosomal. L'RNA totale saranno purificati da questi exosomes per assicurare che siamo in grado di studiare sia l'mRNA e miRNA dallo stesso campione. Dopo la convalida integrità dell'RNA da Bioanalyzer, eseguiremo una produttività quantitativa real time PCR media (qPCR) per identificare il miRNA exosomal utilizzando Taqman Low Density Array (TLDA) carte e studi di espressione genica per le trascrizioni di interesse.
Questi protocolli possono essere usati per quantificare variazioni miRNAs exosomal in pazienti, modelli di roditori e terreni di coltura cellulare prima e dopo l'intervento farmacologico. Contenuto Exosomal variabili per la fonte di origine e le condizioni fisiologiche di cellule che secernono exosomes. Queste variazioni possono fornire informazioni su come le cellule e sistemi di far fronte allo stress o perturbazioni fisiologiche. I nostri dati rappresentativi mostrano variations in miRNA presenti in exosomes purificate dal sangue del mouse, sangue umano e mezzi di coltura di cellule umane.
Qui descriveremo la procedura per analizzare quantitativamente miRNA e RNA messaggero (mRNA) da exosomes secreti nel sangue e nei mezzi di coltura cellulare. Exosomes purificati saranno caratterizzati mediante analisi western blot per i marcatori exosomal e PCR per mRNA di interesse. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e l'etichettatura immunogold verranno utilizzati per convalidare la morfologia e l'integrità exosomal. L'RNA totale saranno purificati da questi exosomes per assicurare che siamo in grado di studiare sia l'mRNA e miRNA dallo stesso campione. Dopo la convalida integrità dell'RNA da Bioanalyzer, eseguiremo una produttività quantitativa real time PCR media (qPCR) per identificare il miRNA exosomal utilizzando Taqman Low Density Array (TLDA) carte e studi di espressione genica per le trascrizioni di interesse.
Questi protocolli possono essere usati per quantificare variazioni miRNA exosomal in pazienti, modelli di roditori e terreni di coltura delle cellule prima e dopo l'intervento farmacologico. Contenuto Exosomal variabili per la fonte di origine e le condizioni fisiologiche di cellule che secernono exosomes. Queste variazioni possono fornire informazioni su come le cellule e sistemi di far fronte allo stress o perturbazioni fisiologiche. I nostri dati rappresentativi mostrano variazioni di miRNA presenti in exosomes purificate dal sangue del mouse, sangue umano e mezzi di coltura di cellule umane
Introduction
Brevi non codificanti miRNA modulano l'espressione genica legandosi al mRNA bersaglio. Seme sequenza di complementarità ~ 7 coppie di basi miRNA consente di legarsi al mRNA bersaglio conseguente inibizione della traduzione o nella riduzione della stabilità del mRNA, entrambi i quali possono portare a diminuzione dell'espressione della proteina bersaglio 1. La ricerca negli ultimi dieci anni ha inequivocabilmente dimostrato un ruolo fondamentale per il miRNA nel mediare le funzioni cellulari. C'è stato anche un notevole sforzo diretto verso la dissezione miRNA cambiamenti molecolari alla base di diverse malattie mediate 2,3. Inoltre, la recente identificazione di miRNA stabili in fluidi corporei 4-6 aperto la strada per il loro uso come nuovi biomarcatori suscettibili di diagnosi clinica.
Un modo di trasporto miRNA nei fluidi corporei è via exosomes, piccole vescicole che trasportano mRNA, proteine, mediatori lipidici, e miRNA alle cellule riceventi tramite cir arteriosa sistemicaione 7-14. Ciò si traduce in modulazione dell'espressione genica in cellule riceventi e rappresenta un nuovo meccanismo di comunicazione cellulare. Per esempio, le cellule possono modulare processi immuno-regolatori secernendo e / o exosomes assorbenti contenenti biomolecole coinvolte nella infiammazione, come interleuchina-1β (IL1β), fattore di necrosi tumorale-α (TNFa), fattore di crescita trasformante-β5 (TGFβ5), e i miRNA che regolano questi geni 13. Come espressione di miRNA aberrante è una caratteristica comune in una varietà di malattie umane, queste molecole offrono nuove interessanti opportunità per la scoperta e la validazione di nuovi bersagli terapeutici 2.
MicroRNA circolanti sono presenti in tutti i fluidi corporei ed è noto che la composizione del exosomes è diverso in base alle celle di origine da cui sono stati rilasciati. Così essi offrono una via per studiare lo stato fisiologico delle cellule e come le cellule cambiano a segnalazione anchets in risposta a stress comprese malattie. Studiare le alterazioni nella composizione exosome può fornire indicazioni in trasduzione del segnale e studiare il loro potenziale utilità come biomarcatori o percorsi di intervento terapeutico.
Qui dimostreremo la purificazione exosomes provenienti da fonti multiple basate su protocolli pubblicati. Questi exosomes saranno utilizzati per l'isolamento dell'RNA seguito da qPCR per identificare e misurare i livelli di miRNA presenti nelle exosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, mostriamo la quantificazione dei miRNA e mRNA da exosomes purificati mediante centrifugazione differenziale di sangue e di cultura dei media. Exosomes hanno diverse componenti che dipendono dalla loro origine e sono coinvolti in una serie di funzioni biologiche, compresa la risposta immunitaria, presentazione dell'antigene, comunicazione intracellulare, e il trasferimento di RNA e proteine 9,11,12,19,20. Mentre la dimensione e la forma è un determinante di purezza exosome, una…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da fondi da Rita Allen sovvenzione della Fondazione per Seena Ajit. Gli autori desiderano ringraziare Erika Balogh e Dr. Soumitra Ghoshroy dall'Università di Centro Electron Microscopy South Carolina per l'uso dello strumento, l'assistenza scientifica e tecnica.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
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