血と文化メディア由来エキソソームの精製およびマイクロRNAプロファイリング
Summary
エキソソーム中の安定したマイクロRNA（miRNA）はの存在は、バイオマーカーとして、また治療的介入のためのルートとしての潜在的有用性のために、細胞間コミュニケーションの新たなモードとして莫大な利益を生成しました。ここでは、搬送中のmiRNAを識別するために、定量PCRに続いて、血液や文化メディアからエキソソーム浄化を示しています。
Abstract
安定したmiRNAは、すべての体液中に存在し、いくつかの循環miRNAはエキソソームと呼ばれる小さな小胞に隔離による分解から保護されています。エキソソームは、標的細胞にRNAおよびタンパク質の転写をもたらす形質膜と融合することができる。彼らの生物学的機能は、免疫応答、抗原提示、および細胞内の通信が含まれています。血液を介した受容細胞における遺伝子発現を調節することができるmiRNAの配信では、ターゲットの介入のための新たな道を開いた。薬物またはRNA治療剤の送達のための戦略を提供するだけでなく、エキソソーム内容は、治療の選択肢と予後を決定する、診断に役立つことができるバイオマーカーとして役立つことができる。
ここでは、定量的に血液および細胞培養培地中に分泌されたエキソソームからのmiRNAとメッセンジャーRNA（mRNAの）を分析するための手順を説明する。精製エキソソームはEXOSためウェスタンブロット分析を用いて特徴づけされます関心のmRNAのためのOMALマーカーとPCR。透過電子顕微鏡（TEM）および免疫金標識は、エキソソーム形態と整合性を検証するために使用される。全RNAを、我々は同じサンプルからmRNAおよびmiRNAの両方を勉強できるようにするために、これらのエキソソームから精製されます。バイオアナライザによるRNAの完全性を検証した後、我々はタックマン低密度アレイ（本件契約）カードと関心の転写産物の遺伝子発現研究を使ってエキソソームのmiRNAを同定するために培地スループット定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を行います。
これらのプロトコルは、薬理学的介入の前と後の患者、げっ歯類モデルおよび細胞培養培地中のエキソソームのmiRNAの変化を定量化するために使用することができる。エキソソーム内容が起源のソースと分泌するエキソソームその細胞の生理学的条件により変動する。これらの変化は、細胞とシステムがストレスや生理的な摂動に対処する方法についての洞察を提供することができます。当社の代表的なデータを示してVマウスの血液、ヒト血液およびヒト細胞培養培地から精製したエキソソームに存在するmiRNAでのariations。
ここでは、定量的に血液および細胞培養培地中に分泌されたエキソソームからのmiRNAとメッセンジャーRNA（mRNAの）を分析するための手順を説明する。精製エキソソームは、関心のあるmRNAのためのエキソソームマーカーおよびPCRのためのウェスタンブロット分析を用いて特徴付けられる。透過電子顕微鏡（TEM）および免疫金標識は、エキソソーム形態と整合性を検証するために使用される。全RNAを、我々は同じサンプルからmRNAおよびmiRNAの両方を勉強できるようにするために、これらのエキソソームから精製されます。バイオアナライザによるRNAの完全性を検証した後、我々はタックマン低密度アレイ（本件契約）カードと関心の転写産物の遺伝子発現研究を使ってエキソソームのmiRNAを同定するために培地スループット定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を行います。
これらのプロトコルは、エキソソームのmiRNAの変化を定量化するために使用することができるiの薬理学的介入の前と後のn個の患者、げっ歯類モデル及び細胞培養培地。エキソソーム内容が起源のソースと分泌するエキソソームその細胞の生理学的条件により変動する。これらの変化は、細胞とシステムがストレスや生理的な摂動に対処する方法についての洞察を提供することができます。我々の代表的なデータは、マウスの血液、ヒト血液およびヒト細胞培養培地から精製エキソソーム中に存在するmiRNAの変化を示す
Introduction
短い非コードmiRNAは、標的mRNAに結合することによって遺伝子発現を調節する。 〜7塩基対の種子配列相補性は、標的タンパク質1の発現低下をもたらすことができ、どちらも翻訳の阻害またはmRNAの安定性の低下を生じる標的mRNAに結合したmiRNAを可能にする。過去10年間の研究では、明確に細胞機能を仲介におけるmiRNAのための基本的な役割を証明しています。また、様々な疾患2,3の根底に miRNAを媒介分子の変化を解剖に向けかなりの努力がなされている。さらに、体液4-6の安定したmiRNAの最近の識別は臨床診断に適した新規バイオマーカーとしての使用のために道を開いた。
体液におけるmiRNAトランスの一態様は、全身の血液circulat経由受容細胞にエキソソーム、mRNAを運ぶ小胞、タンパク質、脂質メディエーター、およびmiRNAを介して行われるイオン7月14日 。このレシピエント細胞における遺伝子発現の調節をもたらし、セルラー通信の新たなメカニズムを表す。例えば、細胞は、増殖因子-β5を（TGFβ5）変換、インターロイキン-1β（IL1β）、腫瘍壊死因子α（TNFα）などの炎症に関与する生体分子を含有する分泌および/または吸収するエキソソームによって免疫調節過程を調節することができると13これらの遺伝子を調節するmiRNA。異常なmiRNA発現は、ヒトの疾患の様々な共通の特徴であるように、これらの分子は、新規治療標的2の発見と検証のためのエキサイティングな新しい機会を提供しています。
循環miRNAは、すべての体液中に存在し、それはエキソソームの組成物は、それらが解放された元のソースセルに基づいて異なることが知られている。こうして彼らは、細胞の生理学的状態を研究するための道を提供し、どのように細胞があってもシグナリングALTER疾患を含むストレスに対する応答のTS。エキソソーム組成物中の変化を研究することは、シグナル伝達への洞察を提供し、バイオマーカーや治療的介入路線としての潜在的有用性を調べることができます。
ここでは、公開プロトコルに基づいて、複数のソースからのエキソソームの精製のデモンストレーションを行います。これらのエキソソームは、RNA単離のために使用されるエキソソーム中に存在するmiRNAのレベルを識別し、測定するために定量PCRを行った。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、我々は、血液や文化メディアからの差動遠心分離により精製エキソソームからのmiRNAとmRNAの定量化を示しています。エキソソームは、その起源に依存して様々な構成要素を有し、免疫応答、抗原提示細胞内通信、RNAおよびタンパク質9,11,12,19,20の伝達を含む生物学的機能の数に関与している。大きさや形状はエキソソーム純度の行列ですが、EMのエキソソームの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究では、リタ·アレン財団助成金からシーナアジットへの資金によってサポートされていました。著者は、楽器の使用、科学的、技術的支援のためのサウスカロライナ州電子顕微鏡センターの大学からエリカバログ博士Soumitra Ghoshroyを確認したいと思います。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
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