Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura
Summary
A presença de microRNAs (miRNAs estáveis) em exossomos gerou enorme interesse como um novo modo de comunicação intercelular, pela sua utilidade potencial como biomarcadores e como uma rota para a intervenção terapêutica. Aqui demonstramos purificação exosome de mídia e cultura de sangue, seguido por PCR quantitativo para identificar os miRNAs sendo transportados.
Abstract
MiRNAs estáveis estão presentes em todos os fluidos do corpo e em alguns miRNAs circulantes são protegidos da degradação por sequestração em pequenas vesículas chamadas exosomes. Exosomes podem fundir com a membrana plasmática que resulta na transferência de RNA e proteínas da célula-alvo. As suas funções biológicas incluem resposta imune, a apresentação de antigénio, e a comunicação intracelular. Entrega de miRNAs que podem regular a expressão do gene em células receptoras através do sangue, abriu novas possibilidades para intervenção alvo. Além de oferecer uma estratégia para a entrega de medicamentos ou agentes terapêuticos RNA, o conteúdo exosomal podem servir como biomarcadores que podem ajudar no diagnóstico, determinar as opções de tratamento e prognóstico.
Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para exosmarcadores Omal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse.
Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal em pacientes, modelos de roedor e meios de cultura de células antes e após a intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostrar variations em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas.
Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para marcadores exosomal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse.
Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal in pacientes, modelos de roedores e meios de cultura de células antes e depois da intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostram variações em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas
Introduction
MiRNAs noncoding Curtas modular a expressão do gene por ligação ao ARNm alvo. Semente sequência complementaridade de pares de bases ~ 7 permite miRNA se liguem ao ARNm alvo, resultando na inibição da tradução ou na redução na estabilidade do mRNA, o que pode resultar na diminuição da expressão da proteína alvo 1. Pesquisas na última década tem se mostrado inequivocamente um papel fundamental para miRNAs em mediar funções celulares. Também tem havido considerável esforço dirigido para dissecar miRNA alterações moleculares subjacentes a diversas doenças mediadas por 2,3. Além disso, a recente identificação de miRNAs estáveis em fluidos corporais 4-6 pavimentou o caminho para a sua utilização como novos biomarcadores passíveis de diagnóstico clínico.
Um modo de transporte miRNA em fluidos corporais é via exossomos, pequenas vesículas que transportam mRNAs, proteínas, mediadores lipídicos e miRNAs em células receptoras via cir arterial sistêmicaion 7-14. Isto resulta na modulação da expressão de genes em células do receptor e representa um novo mecanismo de comunicação celular. Por exemplo, as células são capazes de modular processos de imuno-regulação através da secreção e / ou absorventes exosomes contendo biomoléculas envolvidas na inflamação, tais como a interleucina-1β (IL1β), factor de necrose tumoral α (TNF), factor de crescimento transformante-β5 (TGFβ5) e os miRNAs que regulam estes genes 13. Como expressão de miRNA aberrante é uma característica comum em uma variedade de doenças humanas, estas moléculas oferecem novas oportunidades para a descoberta e validação de novos alvos terapêuticos 2.
Circulating miRNAs estão presentes em todos os fluidos corporais e é sabido que a composição do exosomes é diferente baseada nas células de origem a partir do qual eles foram libertados. Assim, eles oferecem um caminho para estudar o estado fisiológico das células e como as células alteram a sinalização atéts em resposta ao estresse, incluindo doenças. Estudar as alterações na composição exosome pode fornecer insights sobre a transdução de sinal e investigar a sua utilidade potencial como biomarcadores ou rotas de intervenção terapêutica.
Aqui vamos demonstrar a purificação de exossomos a partir de várias fontes baseadas em protocolos publicados. Estes exosomes será usado para o isolamento de ARN seguida por qPCR para identificar e medir os níveis de miRNAs presentes nas exosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, vamos mostrar a quantificação dos miRNAs e mRNAs de exossomos purificados por centrifugação diferencial dos meios de sangue e cultura. Exosomes têm diversos componentes que dependem da sua origem e estão envolvidos em várias funções biológicas, incluindo a resposta imunológica, a apresentação de antigénio, a comunicação intracelular, bem como a transferência de RNA e proteínas 9,11,12,19,20. Embora a forma e tamanho é um determinante de pureza exossomo, uma série de artigo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por fundos de Rita Allen doação da Fundação para Seena Ajit. Os autores gostariam de agradecer Erika Balogh e Dr. Soumitra Ghoshroy da Universidade da Carolina do Sul Centro de Microscopia Eletrônica para o uso do instrumento, assistência técnica e científica.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
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