Purificación y microRNA perfiles de exosomas derivados de la sangre y Cultura Medios
Summary
La presencia de microRNAs estables (miRNAs) en exosomas ha generado gran interés como un nuevo modo de comunicación intercelular, por su utilidad potencial como marcadores biológicos y como una ruta para la intervención terapéutica. Aquí se demuestra la purificación de exosomas sanguíneos y medios de cultivo seguido de PCR cuantitativa para identificar miRNAs que se transportan.
Abstract
MiRNAs estables están presentes en todos los fluidos corporales y algunos miRNAs circulantes están protegidos de la degradación por secuestro en pequeñas vesículas llamadas exosomas. Los exosomas pueden fusionarse con la membrana plasmática que resulta en la transferencia de ARN y proteínas a la célula diana. Sus funciones biológicas incluyen la respuesta inmune, la presentación de antígenos, y la comunicación intracelular. Entrega de miRNAs que pueden regular la expresión génica en las células receptoras a través de la sangre ha abierto nuevas vías para la intervención de destino. Además de ofrecer una estrategia para la administración de fármacos o agentes terapéuticos de ARN, contenido exosomal pueden servir como biomarcadores que pueden ayudar en el diagnóstico, la determinación de las opciones de tratamiento y el pronóstico.
Aquí vamos a describir el procedimiento para el análisis cuantitativo de miRNAs y ARN mensajeros (ARNm) a partir de exosomas secretados en la sangre y de los medios de cultivo de células. Exosomas purificados se caracterizaron mediante análisis de Western blot para exosmarcadores Omal y PCR para ARNm de interés. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y inmunomarcaje se utilizan para validar la morfología y la integridad exosomal. Total de ARN se purificaron a partir de estos exosomas para asegurar que se puede estudiar tanto mRNA y miRNA de la misma muestra. Después de validar la integridad del ARN por Bioanalyzer, vamos a realizar una producción de PCR cuantitativa en tiempo real medio (qPCR) para identificar los genes miARN exosomal utilizando Taqman matriz de baja densidad (TLDA) cartas y estudios de expresión génica de las transcripciones de interés.
Estos protocolos pueden utilizarse para cuantificar los cambios en los miRNAs exosomal en pacientes, modelos de roedores y medios de cultivo de células antes y después de la intervención farmacológica. Contenido exosomal varían debido a la fuente de origen y las condiciones fisiológicas de las células que secretan exosomas. Estas variaciones pueden dar una idea de cómo las células y los sistemas de lidiar con el estrés o perturbaciones fisiológicas. Nuestros datos representativos muestran variations en miRNAs presentes en los exosomas purificados a partir de sangre de ratón, sangre humana y los medios de cultivo de células humanas.
Aquí vamos a describir el procedimiento para el análisis cuantitativo de miRNAs y ARN mensajeros (ARNm) a partir de exosomas secretados en la sangre y de los medios de cultivo de células. Exosomas purificados se caracterizaron mediante análisis de Western blot para detectar marcadores exosomal y PCR para ARNm de interés. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y inmunomarcaje se utilizan para validar la morfología y la integridad exosomal. Total de ARN se purificaron a partir de estos exosomas para asegurar que se puede estudiar tanto mRNA y miRNA de la misma muestra. Después de validar la integridad del ARN por Bioanalyzer, vamos a realizar una producción de PCR cuantitativa en tiempo real medio (qPCR) para identificar los genes miARN exosomal utilizando Taqman matriz de baja densidad (TLDA) cartas y estudios de expresión génica de las transcripciones de interés.
Estos protocolos pueden utilizarse para cuantificar los cambios en los miRNAs exosomal in los pacientes, los modelos de roedores y medios de cultivo de células antes y después de la intervención farmacológica. Contenido exosomal varían debido a la fuente de origen y las condiciones fisiológicas de las células que secretan exosomas. Estas variaciones pueden dar una idea de cómo las células y los sistemas de lidiar con el estrés o perturbaciones fisiológicas. Nuestros datos representativos muestran variaciones en miRNAs presentes en exosomas purificados a partir de sangre de ratón, sangre humana y de los medios de cultivo de células humanas
Introduction
MiRNAs no codificantes cortos modulan la expresión de genes mediante la unión al ARNm diana. Semilla complementariedad de secuencia de ~ 7 pares de bases permite a los genes miARN para unirse al ARNm diana que resulta en la inhibición de la traducción o en la reducción en la estabilidad del ARNm, ambos de los cuales pueden resultar en una disminución de expresión de la proteína diana 1. Las investigaciones realizadas durante la última década se ha demostrado de manera inequívoca un papel fundamental para los miRNAs en la mediación de las funciones celulares. También ha habido un considerable esfuerzo dirigido hacia la disección de los genes miARN cambios moleculares que subyacen a diversas enfermedades mediadas por 2,3. Por otra parte, la reciente identificación de miRNAs estables en los fluidos corporales 4-6 allanó el camino para su uso como nuevos biomarcadores susceptibles de diagnóstico clínico.
Un medio de transporte miRNA en los líquidos corporales es a través de los exosomas, pequeñas vesículas que transportan los ARNm, proteínas, mediadores lipídicos, y miRNAs a las células receptoras a través de la sangre circulante sistémica7-14 de iones. Esto resulta en la modulación de la expresión génica en las células receptoras y representa un nuevo mecanismo de comunicación celular. Por ejemplo, las células pueden modular procesos de inmuno-reguladoras mediante la secreción y / o absorbentes de exosomas que contienen biomoléculas implicadas en la inflamación tales como la interleuquina-1β (IL1), factor de necrosis tumoral-α (TNF), factor de crecimiento transformante-β5 (TGFβ5), y los miRNAs que regulan estos genes 13. Como los genes miARN expresión aberrante es una característica común en una variedad de enfermedades humanas, estas moléculas ofrecen nuevas oportunidades para el descubrimiento y validación de nuevas dianas terapéuticas 2.
MiRNAs circulantes están presentes en todos los fluidos corporales y se sabe que la composición de los exosomas es diferente en función de las celdas de origen de donde fueron liberados. Por lo tanto ofrecen una vía para estudiar el estado fisiológico de las células y cómo las células alteran la señalización inclusots en respuesta al estrés incluyendo enfermedades. El estudio de las alteraciones en la composición exosome puede dar una idea de la transducción de señales e investigar su posible utilidad como biomarcadores o vías de intervención terapéutica.
Aquí vamos a demostrar la purificación de los exosomas de múltiples fuentes basadas en protocolos publicados. Estos exosomas serán utilizados para el aislamiento de ARN seguido por qPCR para identificar y medir los niveles de miRNAs presentes en los exosomas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se muestra la cuantificación de miRNAs y mRNAs de exosomas purificados por centrifugación diferencial a partir de la sangre y los medios de cultivo. Los exosomas tienen diversos componentes que dependen de su origen y están implicados en un número de funciones biológicas, incluyendo la respuesta inmune, la presentación de antígenos, la comunicación intracelular, y la transferencia de ARN y proteínas 9,11,12,19,20. Aunque el tamaño y la forma es un factor determinante de la pureza …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por fondos de subvención de la Fundación Rita Allen a Seena Ajit. Los autores desean agradecer a Erika Balogh y el Dr. Soumitra Ghoshroy de la Universidad de Carolina del Sur Centro de Microscopía Electrónica para el uso de instrumentos, la asistencia científica y técnica.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
