Rensing og microRNA Profilering av Exosomes Avledet fra Blood and Culture Media
Summary
Tilstedeværelsen av stabile microRNAs (miRNAs) i exosomes har generert enorm interesse som en roman modus for intercellular kommunikasjon, for deres potensielle nytten som biomarkører og som en rute for terapeutisk intervensjon. Her viser vi exosome rensing fra blod og kultur media etterfulgt av kvantitativ PCR til å identifisere miRNAs som transporteres.
Abstract
Stabile miRNAs er tilstede i alle kroppsvæsker og noen sirkulerende miRNAs er beskyttet mot nedbrytning ved lagring i små blærer som kalles exosomes. Exosomes kan smelte sammen med plasmamembranen som resulterer i overføring av RNA og proteiner til målcellen. Deres biologiske funksjoner inkluderer immunrespons, antigenpresentasjon, og intracellulær kommunikasjon. Levering av miRNAs som kan regulere genuttrykket i mottakerlandene celler via blod har åpnet nye veier for target intervensjon. I tillegg til å tilby en strategi for levering av legemidler eller RNA terapeutiske midler, kan exosomal innholdet tjene som biomarkører som kan hjelpe i diagnosen, bestemme behandlingsalternativer og prognose.
Her vil vi beskrive prosedyren for kvantitativt analysere miRNAs og messenger RNA (mRNA) fra exosomes utskilles i blodet og cellekulturmedier. Purified exosomes vil være preget bruke western blot analyse for ExosOmal markører og PCR for mRNA av interesse. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og immungullmerkingsteknikk vil bli brukt til å validere exosomal morfologi og integritet. Totalt RNA blir renset fra disse exosomes for å sikre at vi kan studere både mRNA og miRNA fra samme prøve. Etter validering RNA integritet ved Bioanalyzer, vil vi utføre en medium gjennomstrømming kvantitativ sanntids PCR (qPCR) for å identifisere exosomal miRNA hjelp Taqman Low Density Array (TLDA) kort og genuttrykk studier for transkripsjoner av interesse.
Disse protokollene kan brukes til å kvantifisere endringer i exosomal miRNAs hos pasienter, gnager modeller og cellekultur media før og etter farmakologisk intervensjon. Exosomal innholdet variere på grunn av kilden til opprinnelsen og fysiologiske forhold av celler som skiller ut exosomes. Disse variasjonene kan gi innsikt i hvordan celler og systemer takle stress eller fysiologiske forstyrrelser. Våre representative data viser variations i mirnas stede i exosomes renset fra mus blod, menneskeblod og menneskelige cellekulturmedier.
Her vil vi beskrive prosedyren for kvantitativt analysere miRNAs og messenger RNA (mRNA) fra exosomes utskilles i blodet og cellekulturmedier. Purified exosomes vil være preget bruke western blot analyse for exosomal markører og PCR for mRNA av interesse. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og immungullmerkingsteknikk vil bli brukt til å validere exosomal morfologi og integritet. Totalt RNA blir renset fra disse exosomes for å sikre at vi kan studere både mRNA og miRNA fra samme prøve. Etter validering RNA integritet ved Bioanalyzer, vil vi utføre en medium gjennomstrømming kvantitativ sanntids PCR (qPCR) for å identifisere exosomal miRNA hjelp Taqman Low Density Array (TLDA) kort og genuttrykk studier for transkripsjoner av interesse.
Disse protokollene kan brukes til å kvantifisere endringer i exosomal miRNAs in pasienter, gnager modeller og cellekultur media før og etter farmakologisk intervensjon. Exosomal innholdet variere på grunn av kilden til opprinnelsen og fysiologiske forhold av celler som skiller ut exosomes. Disse variasjonene kan gi innsikt i hvordan celler og systemer takle stress eller fysiologiske forstyrrelser. Våre representative data viser presentere variasjoner i miRNAs i exosomes renset fra mus blod, menneskeblod og menneskelige cellekulturmedier
Introduction
Korte noncoding mirnas modulere genuttrykk ved å binde seg til målet mRNA. Seed sekvens komplementaritet ~ 7 basepar muliggjør miRNA å binde seg til mål-mRNA som resulterer i hemming av translasjon eller i reduksjon i stabiliteten av mRNA, som begge kan resultere i redusert ekspresjon av målproteinet 1.. Forskning det siste tiåret har utvetydig bevist en fundamental rolle for miRNAs i formidling cellulære funksjoner. Det har også vært betydelig innsats rettet mot dissekere miRNA medierte molekylære endringer som ligger til grunn ulike sykdommer 2,3. Videre banet siste identifisering av stabile miRNAs i kroppsvæsker 4-6 veien for deres bruk som nye biomarkører mottagelig for klinisk diagnose.
En modus av miRNA transport i kroppsvæsker er via exosomes, små blemmer som bærer mRNA, proteiner, lipid mediatorer, og MiRNAs til mottaker celler via systemisk blod mikrosirkuion 7-14. Dette resulterer i modulering av genekspresjon i mottakercellene og representerer en ny mekanisme for cellulær kommunikasjon. For eksempel kan celler som modulerer immun-regulerende prosesser ved sekresjon og / eller absorberende exosomes inneholdende biomolekyler som er involvert i inflammasjon, for eksempel interleukin-1β (IL1β), tumor nekrose faktor-α (TNF-alfa), transformerende vekstfaktor-β5 (TGFβ5), og de miRNAs som regulerer disse genene 13. Som avvikende miRNA uttrykk er en vanlig funksjon i en rekke menneskelige sykdommer, disse molekylene tilby spennende nye muligheter for oppdagelsen og validering av nye terapeutiske mål to.
Sirkulerende mirnas er tilstede i alle kroppsvæsker og det er kjent at sammensetningen av exosomes er forskjellig basert på kilden celler fra hvilke de ble gitt. Dermed de tilbyr en vei å studere fysiologiske status av cellene og hvordan cellene alter signaliserer endats som svar på stress, inkludert sykdommer. Studerer endringer i exosome sammensetning kan gi innsikt i signaloverføring og undersøke deres potensielle nytten som biomarkører eller terapeutisk intervensjon ruter.
Her vil vi demonstrere rensing av exosomes fra flere kilder basert på publiserte protokoller. Disse exosomes vil bli brukt for RNA isolering etterfulgt av qPCR for å identifisere og måle nivåene av mirnas stede i exosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen, viser vi kvantifisering av miRNAs og mRNA fra exosomes renset av differensial sentrifugering fra blod og kultur media. Exosomes har forskjellige komponenter som er avhengige av deres opprinnelse og er involvert i en rekke biologiske funksjoner, blant annet immunforsvaret, antigen presentasjon, intracellulær kommunikasjon og overføring av RNA og proteiner 9,11,12,19,20. Selv om størrelsen og formen er en determinant for exosome renhet, en rekke papirer på EM-data i exosomes indikerer a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av midler fra Rita Allen Foundation stipend til Seena Ajit. Forfatterne ønsker å takke Erika Balogh og Dr. Soumitra Ghoshroy fra University of South Carolina elektronmikroskopi Center for instrumentbruk, vitenskapelig og teknisk bistand.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
