Summary

Selectieve Tracing van auditieve vezels in de Avian Embryonale evenwichtszenuw Nerve

Published: March 18, 2013
doi:

Summary

Hier beschrijven we een methode, gevolgd door microdissectie fluorescerende kleurstof injectie in de akoestische ganglion vroege kippenembryo's voor selectieve tracering van auditieve axon vezels in de zenuw en achterhersenen.

Abstract

De embryonale kuiken is een veel gebruikt model voor de studie van perifere en centrale ganglion cel projecties. In het auditieve systeem, zou selectieve kenmerken van auditieve axonen in het VIIIe hersenzenuw verbeteren van de studie van de centrale auditieve circuit ontwikkeling. Deze aanpak is een uitdaging omdat meerdere zintuigen van het binnenoor bij te dragen tot de VIIIe zenuw 1. Bovendien markers die betrouwbaar auditieve onderscheiden ten opzichte van vestibulaire groepen van axonen binnen het aviaire VIIIe zenuw moeten nog worden geïdentificeerd. Auditieve en vestibulaire paden kan niet functioneel worden onderscheiden in het begin van embryo's, als zintuiglijke-reacties van de consument zijn niet aanwezig voor het schakelingen worden gevormd. Centraal projecteren VIIIe zenuw axonen zijn getraceerd in sommige studies, maar auditief axon labeling werd gevoegd waarin de door de andere VIIIe zenuw componenten 2,3. We beschrijven een werkwijze voor anterograde tracing van de akoestische ganglion selectief label auditieve axonen in het ontwikkelen van VIIIe zenuw. Ten eerste, na gedeeltelijke ontleding van het voorste Cephalic gebied van een 8-daagse kippenembryo ondergedompeld in zuurstofrijk kunstmatige cerebrospinale vloeistof, wordt het cochleaire kanaal geïdentificeerd door anatomische oriëntatiepunten. Vervolgens wordt een boete getrokken glazen micropipet gepositioneerd om een ​​kleine hoeveelheid rhodamine dextran amine injecteren in het kanaal en diep aangrenzende gebied waar de akoestische ganglion cellen zich bevinden. Binnen dertig minuten na de injectie, zijn auditieve axonen centraal getraceerd in de achterhersenen en kunnen later worden gevisualiseerd na histologische voorbereiding. Deze methode biedt een handig hulpmiddel voor ontwikkelingsstudies van perifeer naar centrale auditieve circuit formatie.

Protocol

1. Bereid de volgende Dissectiemateriaal en reagentia Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM Glucose, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4) continu toegediend met 95% O 2/5% CO 2 bij kamertemperatuur. Voor infusie vullen tot 2/3 van 500 ml met wijde hals Nalgene pot met een gat in het deksel. Tank wordt bevestigd door een glazen buis stam bubbler, die de aCSF dringt door het gat …

Representative Results

De componenten van de VIIIe zenuw en de anatomie van de zenuw zelf complexe en ingewikkelde (figuren 1, 3). Door selectief traceren vezels als gevolg van akoestische ganglioncellen, kan segmenten van de VIIIe zenuw en primaire afferenten auditieve hersenstam binnen de correct worden opgespoord en onderscheiden van hun tegenhangers vestibulaire (figuren 2, 3). Evenzo kan deze techniek gebruikt om perifere projecties van de akoestische ganglion cellen (Figuur 3G) bestuder…

Discussion

Studies van de vroege ontwikkeling van de VIIIe zenuw zijn beperkt voor een deel als gevolg van de moeilijkheid bij het identificeren van embryonale axonen die voortvloeien uit meerdere, afzonderlijke ganglia. Verschillende studies hebben gekeken naar de moleculaire signalen geleiden auditieve en vestibulaire sensorische ganglion cel en celtypes tijdens de vroege ontwikkeling, maar 5,11,12 processen reguleren centrale innervatie nog worden bepaald. Verslagen van akoestische ganglion cel projecties doorgaans b…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen dr. Candace Hsieh bedanken voor suggesties en hulp bij beeldvormende technieken en Dr Doris Wu voor expertise op het gebied chick binnenoor anatomie tijdens de vroege embryogenese. Dit werk werd ondersteund door NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, en DOE GAANN P200A120165.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Polystyrene Weigh Dish Fisher Scientific 02-202-101
Petri Dish, 35 X 10 mm Fisher Scientific 50820644 Use to make silicone dissection dish
Sylgard Silicone Elastomer Kit World Precision Instruments SYLG184 Coat Petri to make dissection dish
Dissection Pins Various Holds embryo in place during dissection
NaCL Various part of aCSF recipe
KCl Various part of aCSF recipe
KH2PO4 Various part of aCSF recipe
NaHCO3 Various part of aCSF recipe
Glucose Various part of aCSF recipe
CaCl2 Various part of aCSF recipe
MgSO4 Various part of aCSF recipe
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. CPLabSafety QP-PLC-03717 Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial American Pharmaceutical Partners, Inc 6332300105 Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler Various Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF
Glass stem bubbler Various To infuse carbogen into aCSF
Curved-tip forceps World Precision Instruments 501008 To remove embryo head from egg
Two fine-tip forceps World Precision Instruments 501985 For micro-dissection
50 ml Beaker various
Rhodamine Dextran Amine (RDA) Invitrogen various Fluorescent axon tracer
Triton X-100 ICN Biomedicals
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) Various Standard lab reagent
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length World Precision Instruments TW120F-4 Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes
Needle / Pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2
Picospritzer Parker Instrumentation various Attach by fine tubing to glass micropipette
Micromanipulator Narishige various
Dissection microscope with fluorescence Various
4% Paraformaldehyde Various Standard lab reagent
anti-Neurofilament antibody, optional Millipore AB1991 Follow histological protocol recommended by manufacturer
Cryostat and associated materials for sectioning Leica various
Epifluorescent microscope for imaging Zeiss, various

References

  1. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
  2. Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
  3. Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
  4. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
  5. Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
  6. Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
  7. Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick’s cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
  8. Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
  9. Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
  10. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  11. Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
  12. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
  13. Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
  14. Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
  15. Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
  16. Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
  17. Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
  18. Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
  19. Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
  20. Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
  21. Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
  22. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
  23. Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).

Play Video

Cite This Article
Allen-Sharpley, M. R., Tjia, M., Cramer, K. S. Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve. J. Vis. Exp. (73), e50305, doi:10.3791/50305 (2013).

View Video