Summary

L'analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

Published: March 18, 2013
doi:

Summary

Qui si descrive una tecnica di microdissezione seguito da iniezione di colorante fluorescente nel ganglio acustico di embrioni di pollo primi selettiva per rintracciare uditive fibre assoni nel nervo e rombencefalo.

Abstract

Il pulcino embrionale è un modello ampiamente utilizzato per lo studio delle proiezioni gangliari periferiche e centrali cellulari. Nel sistema uditivo, etichettatura selettiva degli assoni uditivi all'interno del nervo cranico VIII aumenterebbe lo studio dello sviluppo del circuito uditivo centrale. Questo approccio è impegnativo, perché di vari organi sensoriali dell'orecchio interno contribuiscono al nervo VIII 1. Inoltre, marcatori che distinguono affidabile uditivo rispetto vestibolari gruppi di assoni all'interno del nervo VIII aviaria devono ancora essere identificati. Vie uditive e vestibolari non si distinguono funzionalmente in embrioni precoci, come-sensoriali evocate risposte non sono presenti prima che i circuiti sono formati. Centrale sporgenti assoni dei nervi dell'VIII sono stati rintracciati in alcuni studi, ma uditivo etichettatura assone è stata accompagnata da etichettare dagli altri componenti del nervo dell'VIII 2,3. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi anterograda dal ganglio acustico in modo selettivo labeassoni uditive l all'interno del nervo VIII in via di sviluppo. In primo luogo, dopo la dissezione parziale della regione anteriore cefalica di un 8 giorni di embrione di pollo immerso nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato, il condotto cocleare è identificato da punti di repere anatomici. Successivamente, una micropipetta di vetro sottile tirato è posizionata per iniettare una piccola quantità di rodamina destrano ammina nella regione di canale e adiacente profonda in cui si trovano le cellule gangliari acustici. Entro trenta minuti dopo l'iniezione, assoni uditive sono tracciate a livello centrale nel cervello posteriore e possono poi essere visualizzati a seguito della preparazione istologica. Questo metodo fornisce un utile strumento per gli studi di sviluppo della periferica alla formazione circuito centrale uditivo.

Protocol

1. Preparare i seguenti strumenti di dissezione e reagenti Fluido cerebrospinale artificiale (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM di HEPES, 10 mM di glucosio, 2 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4) continuo infuso con 95% O 2/5% di CO 2 a temperatura ambiente. Per l'infusione, riempire per 2/3 da 500 ml a bocca larga vaso Nalgene con un foro nel coperchio. Serbatoio sarà collegato mediante la tubazione di un …

Representative Results

I componenti del nervo VIII e l'anatomia del nervo stesso sono complessi e contorti (figure 1, 3). Selettivamente rintracciamento fibre derivanti da cellule gangliari acustici, segmenti del nervo VIII nonché uditive afferenti primari all'interno del tronco può essere pulito tracciata e distinti dalle loro controparti vestibolari (figure 2, 3). Analogamente, questa tecnica può essere usata per studiare sporgenze periferiche delle cellule gangliari acustiche (figura 3G)…

Discussion

Studi di sviluppo precoce del nervo VIII sono stati limitati, in parte a causa della difficoltà di identificare assoni embrionali derivanti da più gangli distinti. Diversi studi hanno esplorato i segnali molecolari che guidano uditivo e vestibolare delle cellule sensoriali e destini delle cellule ganglionari durante lo sviluppo iniziale, 5,11,12 ma i processi che regolano innervazione centrale devono ancora essere determinati. Rapporti di proiezioni acustiche cellule gangliari di solito descrivere i process…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Candace Hsieh per suggerimenti e assistenza con le tecniche di imaging e Dr. Doris Wu consultare esperti di anatomia dell'orecchio interno pulcino durante l'embriogenesi precoce. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF IOS-0642346, NIH-DC010775 T32, T32-NIH GM008620, NIH R01-DC010796, e il DOE GAANN P200A120165.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Polystyrene Weigh Dish Fisher Scientific 02-202-101
Petri Dish, 35 X 10 mm Fisher Scientific 50820644 Use to make silicone dissection dish
Sylgard Silicone Elastomer Kit World Precision Instruments SYLG184 Coat Petri to make dissection dish
Dissection Pins Various Holds embryo in place during dissection
NaCL Various part of aCSF recipe
KCl Various part of aCSF recipe
KH2PO4 Various part of aCSF recipe
NaHCO3 Various part of aCSF recipe
Glucose Various part of aCSF recipe
CaCl2 Various part of aCSF recipe
MgSO4 Various part of aCSF recipe
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. CPLabSafety QP-PLC-03717 Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial American Pharmaceutical Partners, Inc 6332300105 Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler Various Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF
Glass stem bubbler Various To infuse carbogen into aCSF
Curved-tip forceps World Precision Instruments 501008 To remove embryo head from egg
Two fine-tip forceps World Precision Instruments 501985 For micro-dissection
50 ml Beaker various
Rhodamine Dextran Amine (RDA) Invitrogen various Fluorescent axon tracer
Triton X-100 ICN Biomedicals
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) Various Standard lab reagent
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length World Precision Instruments TW120F-4 Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes
Needle / Pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2
Picospritzer Parker Instrumentation various Attach by fine tubing to glass micropipette
Micromanipulator Narishige various
Dissection microscope with fluorescence Various
4% Paraformaldehyde Various Standard lab reagent
anti-Neurofilament antibody, optional Millipore AB1991 Follow histological protocol recommended by manufacturer
Cryostat and associated materials for sectioning Leica various
Epifluorescent microscope for imaging Zeiss, various

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Cite This Article
Allen-Sharpley, M. R., Tjia, M., Cramer, K. S. Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve. J. Vis. Exp. (73), e50305, doi:10.3791/50305 (2013).

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