Her beskriver vi en mikrodisseksjon teknikk etterfulgt av fluorescerende fargestoff injeksjon i den akustiske ganglion av tidlige kyllingembryo for selektiv sporing av auditiv axon fibre i nerve og hindbrain.
Embryonale dama er en mye brukt modell for studier av perifere og sentrale ganglion celle anslag. I hørselssystemet, ville selektiv merking av auditiv axoner innenfor VIIIth cranial nerve forbedre studie av sentrale auditive krets utvikling. Denne tilnærmingen er utfordrende fordi flere sanseorganer i det indre øret bidra til VIIIth nerve en. Videre markører som pålitelig skille auditiv versus vestibulære grupper av axoner innenfor luftfarten VIIIth nerve er ennå ikke identifisert. Auditive og vestibular trasé ikke kan skilles funksjonelt i tidlige embryoer, som sensoriske-evoked responser ikke er til stede før kretser er dannet. Sentralt prosjektering VIIIth nerveaxoner har blitt sporet i enkelte studier, men hørbar axon merking ble ledsaget av merking fra andre VIIIth nerve komponenter 2,3. Her beskriver vi en fremgangsmåte for anterograd sporingen fra den akustiske ganglion til selektivt Label auditiv axons innenfor utvikling VIIIth nerve. Først, etter delvis disseksjon av fremre cephalica regionen av en 8-dagers kylling embryo nedsenket i oksygenert kunstig cerebrospinalvæske, er cochlea duct identifisert av anatomiske landemerker. Deretter ble et fint trakk glass mikropipette posisjonert å injisere en liten mengde rhodamin dekstran amin inn i kanalen og tilstøtende dype regionen hvor de akustiske ganglion celler er plassert. Innen tretti minutter etter injeksjonen, er hørbar axons spores sentralt i hindbrain og kan senere bli visualisert etter histologisk forberedelse. Denne metoden gir et nyttig verktøy for utviklingsstudier av perifer til sentrale auditive krets formasjon.
Studier av den tidlige utviklingen av VIIIth nerve har vært begrenset i delvis på grunn av vanskeligheter med å identifisere embryonale axoner oppstår fra multiple distinkte ganglier. Flere studier har utforsket de molekylære signaler guiding auditive og vestibulære sensoriske celle og ganglion celle skjebner under tidlig utvikling, 5,11,12, men prosessene som regulerer sentrale innervasjon er ennå ikke bestemt. Rapporter om akustiske ganglion celle anslag vanligvis beskrive perifere prosesser til sens…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke dr. Candace Hsieh for forslag og hjelp med avbildningsteknikker og Dr. Doris Wu for kompetanse på chick indre øret anatomi under tidlig embryogenese. Dette arbeidet ble støttet av NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, og DOE GAANN P200A120165.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
KCl | Various | part of aCSF recipe | |
KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
50 ml Beaker | various | ||
Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
Micromanipulator | Narishige | various | |
Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |