Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias
Summary
Aquí describimos una técnica de microdisección seguida de la inyección de tinte fluorescente en el ganglio de la acústica de los primeros embriones de pollo para el seguimiento selectivo de las fibras auditivas axones en el nervio y cerebro posterior.
Abstract
El embrión de pollo es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de las proyecciones de células ganglionares centrales y periféricas. En el sistema auditivo, el etiquetado selectivo de los axones en el nervio auditivo craneal VIII aumentaría el estudio del desarrollo central de circuito auditivo. Este enfoque es un reto porque varios órganos sensoriales del oído interno contribuir al nervio VIII 1. Además, los marcadores que distinguir confiablemente auditivo frente a los grupos vestibulares de los axones a la aviar nervio VIII aún no se han identificado. Vías auditivas y vestibular no pueden distinguirse funcionalmente en los embriones tempranos, como sensoriales evocados por las respuestas no están presentes antes de los circuitos se forman. Centralmente se proyectan axones del nervio VIII han sido localizados en algunos estudios, pero auditivo etiquetado axón fue acompañado por el etiquetado de otros componentes nerviosos VIII 2,3. Aquí se describe un método para la anterógrada trazado del ganglio acústico para selectivamente label axones del nervio auditivo dentro VIII desarrollo. En primer lugar, después de la disección parcial de la región cefálica anterior de un embrión de pollo de 8-día sumergido en fluido cerebroespinal artificial oxigenado, el conducto coclear es identificado por puntos de referencia anatómicos. A continuación, una micropipeta fina tira de cristal está posicionado para inyectar una pequeña cantidad de rodamina dextrano amina en la región profunda del conducto y adyacente donde las células ganglionares de la acústicos se encuentran. Dentro de los treinta minutos después de la inyección, los axones auditivos se remontan centralmente en el cerebro posterior y más tarde se puede visualizar después de la preparación histológica. Este método proporciona una herramienta útil para los estudios de desarrollo de periféricos al centro de formación de circuito auditivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudios sobre el desarrollo temprano del nervio VIII se han limitado, en parte debido a la dificultad en la identificación de los axones embrionarias derivadas de los ganglios de distinta múltiple. Varios estudios han explorado las señales moleculares que guían auditivo y vestibular célula sensorial y destinos de células ganglionares durante el desarrollo temprano, 5,11,12 pero los procesos que regulan la inervación central tienen todavía por determinar. Informes de acústicos proyecciones de célula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Dra. Candace Hsieh para sugerencias y ayuda con técnicas de imagen y la Dra. Doris Wu por su experiencia en la anatomía del oído interno pollito durante la embriogénesis temprana. Este trabajo fue apoyado por NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 y DOE GAANN P200A120165.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
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