Carcinogenesis er en proces, der involverer interaktioner mellem kræftceller og kræft mikromiljø. At dissekere de molekylære begivenheder, er man nødt til at isolere forskellige cellepopulationer på forskellige stadier under udviklingen af kræft. Ved hjælp af en musemodel for basalcellekræft, beskriver vi en protokol for celle analyser under carcinogenese.
Udviklingen af kræft er en multiple-trins proces, der involverer mange celletyper, herunder cancer precursorceller, immunceller, fibroblaster og endotelceller. Hver type af celler undergår signalering og funktionelle forandringer under carcinogenese. Den aktuelle udfordring for mange kræftforskere er at dissekere disse ændringer i hver celle type i multiple-trins proces in vivo. I de sidste par år, har forfatterne udviklet et sæt procedurer til at isolere forskellige cellepopulationer under hudkræft udvikling ved hjælp K14creER/R26-SmoM2 YFP mus. Proceduren er opdelt i 6 dele: 1) generere passende mus til studiet (K14creER + og R26-SmoM2 YFP + mus i denne protokol) 2) fremkaldende SmoM2 YFP udtryk i musehud, 3) udarbejdelse mus hudbiopsier, 4) at isolere epidermis fra huden, 5) forbereder enkelte celler fra overhuden, 6) mærkning encellede populationer for flowcytometri analyse.Generering af tilstrækkeligt antal mus med den rigtige genotypen er den begrænsende skridt i denne protokol, som kan tage op til to måneder. Resten af trinene tage et par timer til et par dage. Inden for denne protokol, vi også indeholder et afsnit for fejlfinding. Selvom vi fokuserer på hudkræft, kan denne protokol modificeres til at ansøge om andre dyremodeller for humane sygdomme.
Som den mest almindelige form for kræft hos mennesker, påvirker basalcellekræft (BCC) omkring 2 millioner amerikanere om året 1.. Akkumulere beviser tyder på, at unormal aktivering af pindsvin (hh) signalering er den drivende kraft bag BCC udvikling (Bedømt i 2,3). Ændringer i Hh signalering i BCC omfatter inaktiverende mutationer af PTCH1 4-6, gain-of-funktion mutationer af SMO 7-9, og afvigende udtryk HH pathway transkriptionsfaktorer GLI1 10 og GLI2 11 eller sjældne inaktiverede mutationer af negativ regulator Su (Fu ) 12. Gennem alle disse og andre studier har Federal Drug Administration (FDA) har for nylig godkendt brugen af Hh signalering inhibitor Vismodegib at behandle metastatisk og lokalt fremskreden BCC 13-15.
På trods af alle disse resultater 16 vi stadig ikke forstår de molekylære og cellulære mekanismer, som Hh signalering driver carcinogenesis. Etablering dyremodeller med vævs-specifik aktivering af Hh signalering er stadig vigtigt for disse undersøgelser og for vores forståelse af resistens. Hos mus har vildtypemus ikke udvikle BCC, selv under tunge doser af kræftfremkaldende stoffer, UV-eller ioniserende stråling. I modsætning Ptch1 + / – er mus modtagelige for BCC udvikling 17,18. Den penetrans af BCC udvikling i Ptch1 + / – mus er over 50% 18,19 selvom Ptch1 + / – mus udvikler sjældent fuldvoksne BCC, hvis de opbevares under normale forhold. På grund af den embryonale letalitet Ptch1 – / -, vævs-specifik knockout af PTCH1 almindeligvis anvendes til undersøgelsen 20. Desuden betingede skin-specifikt udtryk for onkogene SmoM2 YFP (Krt14-creer: R26-SmoM2 YFP: R26-SmoM2 YFP eller Krt14-cre) fører til dannelse af flere mikroskopiske BCC i en meget tidlig alder, der giver en nem genetisk analyse for hh signalering gørwnstream af SMO 21.
Der er tre store spørgsmål i vores viden om BCC biologi. Først, den cellulære oprindelse BCC er ikke helt klar. Mens nogle undersøgelser understøtter rokke af hårsækken, da stamceller webstedet 22-24, Youssef et al. 25. lokaliseret den murine celle oprindelse kutane Hh-drevet tumorer at være i inter-follikulært epidermis region, ikke i hårsækken , ved hjælp af cellespecifik Cre at aktivere ekspression af et ROSA26-drevet transgen mutant SMO. Sekund, cellulære interaktioner under BCC udvikling er ikke godt forstået. Det vides, at keratinocytter med aktiverede Hh signalering kan føre til dannelse af BCC, men andre cellulære ændringer er ikke godt forstået. Endvidere kan behandling af SMO antagonister i mus fører til resistens 26-28. Således nye mål for BCC er stærkt behov for. Forståelsen af disse tre spørgsmål kræver analyser af celleforandringer hos mus under carcinogenesis. Mens flere metoder er blevet offentliggjort keratinocytkultur, flowcytometri og hud stamceller isolation 29-31, der i øjeblikket ingen omfattende procedurer for celle analyser i mus BCC. Ved at kombinere metoder til musemodel af BCC, adskillelse af epidermis, generering af enkelte celler fra væv og celler analyser, vil vi give læserne med et sæt af procedurer til at studere celle signalering, cellulære og molekylære interaktioner i løbet af BCC udvikling. Vi mener, at denne protokol vil give læserne at se, hvordan hver enkelt procedure er gennemført. Desuden fremlagde vi nogle data til at illustrere hvad resultaterne skal se ud, og fejlfinding for at hjælpe læserne til at overvinde vanskeligheder under udførelsen af disse procedurer.
Vi har beskrevet en fremgangsmåde til cellepopulation analyse i BCC. Tumorvæv er konsekvent af mange celletyper, og hver celletype opfører sig anderledes på et givet tidspunkt af carcinogenese, hvilket er meget svært at genvinde selv under de bedste in vitro-betingelser. Ved hjælp af denne protokol, viste vi, at udviklingen af basalcellekræft er ledsaget af udvidelsen af epidermale stamceller samt rekruttering af myeloide celler. I sammenligning med immunhistokemisk eller immunofluorescensglas analyser giver cellepopulation analyser en mere kvantitativ vurdering af cellepopulation ændringer, da specifikke antistoffer til en række celletyper er nu tilgængelige.
Til denne protokol, er 10 uger til at fuldføre studiet, fordi fænotypisk ændring fra geninduktion kræver tid. Det er derfor vigtigt at planlægge eksperimentet i forvejen. For celle isolation og analyser kan to hele dage være nødvendig. Fordi levende celler anvendes til analyses, er det vigtigt at reservere en FACSCalibur forvejen. Vi har også opført almindelige problemer når der arbejdes med denne protokol (se nedenfor).
Det er vores erfaring, er under fælles problemer, vi stødte:
Denne protokol kan kombineres med knoglemarvstransplantation eller vævstransplantation at undersøge celle oprindelse. For eksempel GFP-udtrykkende transplantation af knoglemarvsceller i letalt bestrålede mus vil tillade os at undersøge bidraget af knoglemarvsceller til tumorassocierede fibroblaster og myeloide celler. Tilsvarende kan hudtumorer blive transplanteret ind i en ny mus vært at undersøge tumor-vært interaktioner.
Ud over at undersøge cellepopulation forandringer under karcinogenese vil denne protokol også give forskere til at undersøgevirkninger af lægemiddelbehandlinger til cellerne i tumoren miljø. Selv om denne protokol er designet til at bruge til cellepopulation analyser under hudkræft, mindre ændringer kan foretages for andre kræfttyper.
Sammenfattende kan cellepopulation analyser musemodeller af hudkræft give os de dynamiske cellulære ændringer i karcinogenese, hvilket fører til en bedre forståelse af cellebiologi i neoplastisk transformation og forskellige cellulære begivenheder i omstillingsprocessen.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af NCI (R01-94160 og R01-155086), IU Simon Cancer Center og Wells Center for Pediatric Research.
Reagents | Company | Cat# | Comments |
directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |