إسكات طويلة الأجل من Intersectin-1S في الرئتين الماوس عن طريق المتكررة تسليم سيرنا محددة عبر الليبوزومات الموجبة. تقييم تأثيرات ضربة قاضية بواسطة المجهر الإلكتروني
Summary
تكرار الحقن الرجعية المدارية من liposomes/siRNA/ITSN-1s الموجبة المجمعات في الفئران، كل 72 ساعة لمدة 24 يوما، وتقديم كفاءة دوبلكس سيرنا إلى الماوس الرئة الأوعية الدموية الدقيقة الحد مرنا ITSN-1S والتعبير البروتين بنسبة 75٪. هذا الأسلوب هو تكرار للغاية في نموذج حيواني، ليس له آثار سلبية والابتعاد عن حالة وفاة.
Abstract
وأظهرت دراسات سابقة أن ضربة قاضية من ITSN-1S (KD ITSN)، وهو البروتين التقامي تشارك في تنظيم الرئة نفاذية الأوعية الدموية والخلايا البطانية (ECS) البقاء على قيد الحياة، يسببها موت الخلايا أفكارك، عقبة رئيسية في تطوير نظام زراعة الخلايا لفترات طويلة مع ITSN-1S تثبيط 1. باستخدام الجسيمات الشحمية الموجبة وناقلات، ونحن استكشاف إسكات الجينات ITSN-1S في الرئتين الماوس عن طريق الإدارة النظامية من سيرنا استهداف ITSN-1 الجين (ITSN سيرنا). الجسيمات الشحمية الموجبة توفر العديد من المزايا للتسليم سيرنا: آمن مع الجرعات المتكررة، nonimmunogenic، غير سام، وسهلة لإنتاج 2. أداء الجسيمات الشحمية والنشاط البيولوجي تعتمد على حجمها، تهمة، الدهون تكوين والاستقرار، جرعة وطريقة التعاطي 3 هنا وكفاءة وITSN دينار كويتي محددة في الرئتين الماوس قد تم الحصول عليها باستخدام مزيج بروميد الأمونيوم dioctadecyl الكولسترول وثنائي ميثيل. التسليم في الوريدمن ITSN سيرنا / المجمعات الحويصلية الموجبة طرقت عابر أسفل البروتين ITSN-1S ومرنا في الرئتين الماوس في يوم 3، والذي تعافى بعد 3 أيام إضافية. الاستفادة من الجسيمات الشحمية الموجبة باعتبارها الناقل آمنة للتكرار، وسعت الدراسة لمدة 24 يوما. وهكذا، كانت تدار العلاج الرجعية المدارية مع المجمعات ولدت حديثا كل يوم 3، الأمر الذي أدى ITSN دينار كويتي مستمرة طوال فترة الدراسة 4. وتعرض الأنسجة الماوس جمعها في عدة نقاط زمنية ITSN بعد سيرنا إلى المجهر (EM) تحليلات الإلكترون لتقييم آثار دينار كويتي ITSN المزمنة، في البطانة الرئة. سمح عالية الدقة EM التصوير لنا لتقييم التغيرات المورفولوجية التي تسببها KDITSN في السرير الوعائي الرئوي (أي تعطل حاجز البطانية، انخفض عدد caveolae وupregulation من مسارات نقل بديلة)، وخصائص غير القابلة للكشف بواسطة المجهر الضوئي. عموما أنشئت هذه النتائج والمجمدةدور تانت من ITSN-1S في وظيفة ECS والتوازن الرئة، في حين توضح فعالية تسليم سيرنا-الجسيمات الشحمية في الجسم الحي.
Introduction
سيرنا المجردة لا يمكن أن تخترق غشاء الخلية، ويجري سالبة الشحنة، وأنه هو المتدهورة بسهولة عن طريق الانزيمات في الدم والأنسجة، والخلايا. حتى مع مؤخرا تعديلات هيكلية لتحسين الاستقرار، وتراكم سيرنا في الموقع المستهدف بعد تناوله منخفضة للغاية ويتطلب وسيلة فعالة داخل الخلايا 5. ظهرت الجسيمات الشحمية الموجبة كما آمن الأحماض النووية ناقلات مع القدرة على نقل قطع كبيرة من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في الخلايا عن طريق التغليف وحماية الأحماض النووية من تدهور الأنزيمية 6. أيضا، الجسيمات الشحمية الموجبة تتفاعل تلقائيا مع DNA / RNA، وبالتالي تعزيز نقل الجينات إلى الخلايا 2. وفي الآونة الأخيرة تم تطبيق الجسيمات الشحمية لتقديم اللقاحات والأدوية الجزيئي المنخفض الوزن 7. تسليم الليبوسومال من الرنا الميكروي-7-معربا عن البلازميد يتغلب عامل نمو البشرة مستقبلات التيروزين كيناز المانع للمقاومة في خلايا سرطان الرئة 8. عند استهدافبطانة الأوعية الدموية، والتسليم في الوريد أمر ضروري لأن المجمعات من غير المرجح أن عبور حاجز البطانية ويتسرب في النسيج الخلالي إلى 9. وعلى سبيل المقارنة إلى أعضاء أخرى، ECS من الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة يكون لها أكبر امتصاص واستيعاب بشوق الحويصلية الموجبة وDNA / RNA المجمعات، يليه الغدد الليمفاوية وبقع باير 9. وقد ثبت التسليم عن طريق الوريد في نماذج القوارض من سيرنا عبر حقن الوريد الرجعية المدارية أو الذيل غير مؤذية حتى في تركيزات عالية، مثل 50 مغ / كغ 10. في الكتابات المنشورة تكوين الجسيمات الشحمية الموجبة يختلف، استنادا إلى صياغة الدهون ونسبة متساوي المولية من 11 و 12. هناك طائفة واسعة من التطبيقات المحتملة باستخدام الجسيمات الشحمية الموجبة للتسليم الجينات في الجسم الحي، سواء استهداف down-regulation/over-expression من البروتينات، والتسليم لقاحات أو علاجات المضادة للورم 13-15. المهم أن نتذكرغير أن كفاءة DNA / RNA الخلوية التفاعل غشاء ينظم شكل اقتران بين المجمعات ولدت والدهون غشاء. هذا يشير إلى أن الخياطة تكوين الدهون إلى ملامح الغشاء الخلوي المستهدف قد يكون مفيدا ويؤدي إلى ارتفاع معدلات ترنسفكأيشن في نوع خلية معينة 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
استنادا إلى الدراسات السابقة التي نشرت من قبل الآخرين ولنا 9 1، 18 وضعنا هذه المنهجية على المدى الطويل نهدم من ITSN-1S في الجسم الحي بواسطة الوريد المتكررة (كل ساعة 72، لمدة 24 يوما متتالية) من سيرنا محددة / المجمعات الحويصلية. هذا النهج التجريبي هو كفاءة، ويمكن اس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01HL089462 ليرة سورية.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) | Sigma-Aldrich | D2779 | |
| LiposoFast stabilizer (mini-extruder) | Avestin Inc. | LF-STB | |
| Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore | Avestin Inc. | LFM-50 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8667 | |
| Chloroform | Mallinckrodt Chemicals | 4432-04 | |
| Hank’s balanced salts | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Round-bottom flask | Fisher Scientific | FHB-275-030X | |
| Mouse siRNAITSN – on target | Dharmacon/ThermoScientific | J-046912-11 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | REGLO-CDF digital with RHOO pump head | |
| Ventilator | Hugo Sachs Electronik | NA | |
| Barbital | Sigma-Aldrich | B-0500 | |
| Uranyl acetate | EM Sciences | 22400 | |
| Epon812 | EM Sciences | Discontinued by the manufacturer | |
| Propylene oxide | EM Sciences | 20400 | |
| Embedding molds | EM Sciences | 69923-05 | |
| Tannic acid | EM Sciences | 21710 | |
| 8 nm gold-albumin tracer | Prepared in the laboratory as in16 | ||
| Comments | |||
| Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1) | |||
| Pyrex, 100 ml | |||
| Modified siRNA, in vivo | |||
| Part of IDEX corp. | |||
| D-79232 March, Germany | |||
| Replaced with Embed812, cat. # 14120 |
References
- Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
- Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
- Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
- Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
- Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
- Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
- Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
- McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
- Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
- Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
- Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
- Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
- Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
- Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
- Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
- Miyawaki-Shimizu, K., et al. . Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).
