זריקות רטרו מסלולית חוזרות ונשנות של מתחמי קטיוני liposomes/siRNA/ITSN-1s בעכברים, בכל 72 שעות למשך 24 ימים, ביעילות לספק דופלקס siRNA לmicrovasculature ריאות עכבר הפחתת mRNA ITSN-1S וביטוי חלבון על ידי 75%. טכניקה זו היא שחזור מאוד במודל של בעלי חיים, אין לו תופעות לוואי ונמנע הרוגים.
מחקרים קודמים הראו כי מציאה של ITSN-1S (KD ITSN), חלבון endocytic המעורב בויסות חדירות כלי דם וריאות תאי האנדותל (ECS) הישרדות, מוות של תאי אפופטוטיים מושרה, מכשול עיקרי בפיתוח מערכת תרבית תאים עם ITSN-1S ממושך עיכוב 1. באמצעות ליפוזומים קטיוני כנשאים, בחן את ההשתקה של גן ITSN-1S בעכבר ריאות על ידי ממשל מערכתי של siRNA גן מיקוד ITSN-1 (ITSN siRNA). ליפוזומים קטיוני מציעים מספר יתרונות למסירת siRNA: בטוח במינון חוזר ונשנה, nonimmunogenic, רעילים, וקלים לייצור 2. ביצועים ליפוזומים ופעילות ביולוגית שלהם תלויות בגודל, תשלום, שומנים הרכב, יציבות, מינון ודרך מתן 3 הנה, יעיל והספציפי בITSN KD ריאות עכבר הושג באמצעות שילוב רומיד אמוניום dioctadecyl כולסטרול ודימתיל. משלוח תוך ורידישל ITSN siRNA / מתחמי liposome קטיוני דפקו transiently למטה חלבון ITSN-1S וmRNA בעכבר ריאות ביום 3, שהתאושש לאחר 3 ימים נוספים. מנצלים את יפוזומים קטיוני כמוביל בטוח הדיר, המחקר הוארך למשך 24 ימים. לפיכך, טיפול רטרו מסלולית עם מתחמים טריים שנוצרו היה מנוהל בכל יום 3, גרימת ITSN KD המתמשך לאורך כל תקופת המחקר 4. רקמות עכבר שנאספו במספר הנקודות ITSN לאחר זמן siRNA היו נתונים למיקרוסקופים אלקטרונים (EM) ניתוחים כדי להעריך את ההשפעות של KD ITSN הכרוני, בהאנדותל ריאות. רזולוציה גבוהה EM הדמיה אפשרה לנו להעריך את השינויים מורפולוגיים שנגרמו על ידי KDITSN במיטת כלי דם הריאה (כלומר שיבוש של מכשול אנדותל, מספר caveolae וupregulation של מסלולי תחבורה חלופיים ירד), מאפיינים שאינם לזיהוי על ידי מיקרוסקופ אור. בסך הכל ממצאים אלו הוקמו imporהתפקיד של TANT ITSN-1S בתפקוד ECs והומאוסטזיס ריאות, ואילו הממחיש את היעילות של ליפוזומים משלוח siRNA בin vivo.
siRNA בלתי מזוינת לא יכול לחדור את קרום התא, שטעון שלילי, וזה בקלות מושפל על ידי אנזימים בדם, רקמות ותאים. אפילו עם לאחרונה שינויים מבניים לשיפור יציבות, הצטברות siRNA באתר היעד לאחר מתן היא נמוכה ביותר ודורשת רכב תאי יעיל 5. ליפוזומים קטיוני התפתחו כנשאים חומצות גרעין בטוחים עם הפוטנציאל להעברת חלקים גדולים של ה-DNA / RNA לתאים על ידי encapsulating והגנה על חומצות גרעין משפלה האנזימטית 6. כמו כן, ליפוזומים קטיוני אינטראקציה באופן ספונטני עם DNA / RNA, ובכך לקדם העברת גנים לתאים 2. לאחרונה יפוזומים יושמו כדי לספק חיסונים ותרופות מולקולריים נמוכה במשקל 7. משלוח liposomal של microRNA-7-להביע פלסמיד מתגבר על גורם הקולטן טירוזין קינאז מעכב גדילה באפידרמיס-התנגדות בתאי סרטן ריאות 8. כאשר מיקודהאנדותל של כלי דם, האספקה תוך ורידי הוא חיוני משום המתחמים צפויים לחצות את מחסום האנדותל וextravasate לinterstitium 9. על ידי השוואה לאיברים אחרים, ECS מmicrovasculature של הריאה יש הספיגה הגדולה ביותר בשקיקה ולהפנים יפוזום קטיוני ומתחמי DNA / RNA, ואחריו את בלוטות הלימפה והטלאים של Peyer 9. משלוח תוך ורידי במודלים של מכרסמים של siRNA באמצעות זריקות וריד רטרו מסלולית או זנב הוכח בלתי מזיק גם בריכוזים גבוהים, כגון 50 מ"ג / ק"ג 10. בספרות שפורסמה בהרכב ליפוזומים קטיוני שונה, המבוסס על ניסוח שומנים והיחס שלהם equimolar 11, 12. יש מגוון רחב של יישומים אפשריים באמצעות ליפוזומים קטיוני למסירת גן in vivo, בין אם מיקוד down-regulation/over-expression של החלבונים, משלוח של חיסונים או טיפולים אנטי סרטניים 13-15. חשוב לזכורהוא שהיעילות של אינטראקציה קרום DNA / RNA-הסלולר מוסדרת על ידי צורת צימוד בין מתחמים שנוצרו ושומנים בממברנה. הדבר מצביע על כך חייטות הרכב שומנים לפרופילי הממברנה התאיים הממוקדים עשויה להיות מועילה ותוצאה בשיעור גבוה של transfection בסוג תא מסוים 6.
בהתבסס על מחקרים קודמים שפורסמו על ידי אחרים ו9 1, 18 שפתחנו מתודולוגיה זו לטווח ארוך להפיל של ITSN-1S in vivo על ידי עירוי לוריד חזר (בכל שעה 72, במשך 24 ימים רצופים) של siRNA הספציפי / מתחמי liposome. גישה ניסויית זה היא יעילה, בטוח לשימוש ושוב ושוב וניתן להרחיב אותו בקלות כדי…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01HL089462 לSP.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) | Sigma-Aldrich | D2779 | |
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) | Avestin Inc. | LF-STB | |
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore | Avestin Inc. | LFM-50 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8667 | |
Chloroform | Mallinckrodt Chemicals | 4432-04 | |
Hank’s balanced salts | Sigma-Aldrich | H1387 | |
Round-bottom flask | Fisher Scientific | FHB-275-030X | |
Mouse siRNAITSN – on target | Dharmacon/ThermoScientific | J-046912-11 | |
Peristaltic pump | Ismatec | REGLO-CDF digital with RHOO pump head | |
Ventilator | Hugo Sachs Electronik | NA | |
Barbital | Sigma-Aldrich | B-0500 | |
Uranyl acetate | EM Sciences | 22400 | |
Epon812 | EM Sciences | Discontinued by the manufacturer | |
Propylene oxide | EM Sciences | 20400 | |
Embedding molds | EM Sciences | 69923-05 | |
Tannic acid | EM Sciences | 21710 | |
8 nm gold-albumin tracer | Prepared in the laboratory as in16 | ||
Comments | |||
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1) | |||
Pyrex, 100 ml | |||
Modified siRNA, in vivo | |||
Part of IDEX corp. | |||
D-79232 March, Germany | |||
Replaced with Embed812, cat. # 14120 |