धनायनित Liposomes के माध्यम से एक विशिष्ट siRNA के दोहराया डिलिवरी द्वारा माउस फेफड़े में Intersectin-1s के लंबे समय तक मुंह बंद. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पछाड़ना प्रभाव का मूल्यांकन
Summary
चूहों में cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s परिसरों, 24 दिनों के लिए हर 72 घंटे के दोहराया रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन, कुशलता 75% से ITSN-1s mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति को कम करने के लिए माउस फेफड़ों microvasculature को siRNA द्वैध देने. इस तकनीक में एक पशु मॉडल में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, कोई प्रतिकूल असर पड़ता है और मौत से बचा जाता है.
Abstract
पिछले अध्ययनों ITSN-1s (केडी ITSN), फेफड़े संवहनी पारगम्यता और endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) अस्तित्व, प्रेरित apoptotic कोशिका मृत्यु, ITSN-1s लंबे समय तक साथ एक सेल संस्कृति प्रणाली के विकास में एक प्रमुख बाधा को विनियमित करने में शामिल एक endocytic प्रोटीन की कि पछाड़ना पता चला निषेध 1. वाहक के रूप में धनायनित लाइपोसोम का उपयोग करना, हम ITSN -1 जीन (siRNA ITSN) को लक्षित siRNA के प्रणालीगत प्रशासन द्वारा माउस फेफड़ों में ITSN-1s जीन का मुंह बंद करने का पता लगाया. 2 निर्माण करने के लिए, दोहराया खुराक के साथ सुरक्षित nonimmunogenic, nontoxic है, और आसान: cationic liposomes siRNA वितरण के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं. Liposomes प्रदर्शन और जैविक गतिविधि एक कोलेस्ट्रॉल और डाइमिथाइल dioctadecyl अमोनियम ब्रोमाइड संयोजन का उपयोग करके अपने आकार, प्रभारी, लिपिड रचना, स्थिरता, खुराक और प्रशासन 3 के मार्ग यहाँ, कुशल और प्राप्त किया गया है माउस फेफड़ों में विशिष्ट केडी ITSN पर निर्भर करते हैं. नसों में प्रसवsiRNA के ITSN की / धनायनित liposome परिसरों क्षणिक अतिरिक्त 3 दिनों के बाद बरामद किया जो दिन 3 पर माउस फेफड़ों में ITSN-1s प्रोटीन और mRNA, नीचे गिरा दिया. एक repeatable सुरक्षित वाहक के रूप में धनायनित लाइपोसोम का लाभ उठाते हुए, अध्ययन के 24 दिनों के लिए बढ़ा दी. इस प्रकार, हौसले से उत्पन्न परिसरों के साथ रेट्रो कक्षीय उपचार अध्ययन 4 भर में निरंतर केडी ITSN उत्प्रेरण, हर 3 दिन दिलाई. कई बार अंक के बाद siRNA के ITSN में एकत्र माउस ऊतकों फेफड़ों endothelium में, पुरानी केडी ITSN के प्रभाव का मूल्यांकन करने के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) विश्लेषण के अधीन थे. उच्च संकल्प ईएम इमेजिंग हमें फेफड़े संवहनी बिस्तर में KDITSN की वजह से morphological परिवर्तन का मूल्यांकन करने की अनुमति प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेषताओं गैर detectable, (endothelial बाधा यानी विघटन, caveolae की संख्या और वैकल्पिक परिवहन रास्ते की upregulation कमी आई). कुल मिलाकर इन निष्कर्षों को एक महत्वपूर्ण स्थापितईसीएस समारोह और फेफड़ों homeostasis में ITSN-1s के उग्रवादी भूमिका, विवो में siRNA-liposomes के वितरण की प्रभावशीलता को चित्रित करते हुए.
Introduction
नंगे siRNA में, कोशिका झिल्ली घुसना नहीं कर सकते हैं नकारात्मक आरोप लगाया जा रहा है, और यह रक्त में एंजाइमों, ऊतकों और कोशिकाओं द्वारा आसानी से अपमानित है. यहां तक कि स्थिरता में सुधार करने के लिए हाल ही में संरचनात्मक संशोधनों के साथ प्रशासन के बाद लक्ष्य साइट में siRNA संचय बेहद कम है और एक कुशल इंट्रासेल्युलर वाहन 5 की आवश्यकता है. Cationic liposomes encapsulating और एंजाइमी गिरावट 6 से न्यूक्लिक एसिड की रक्षा के द्वारा कोशिकाओं में डीएनए / आरएनए के बड़े टुकड़े हस्तांतरण करने की क्षमता के साथ सुरक्षित न्यूक्लिक एसिड वाहक के रूप में उभरा. इसके अलावा, cationic liposomes अनायास इस प्रकार की कोशिकाओं के लिए 2 जीन स्थानांतरण को बढ़ावा देने, डीएनए / आरएनए के साथ बातचीत. अभी हाल ही में liposomes के टीके और कम आणविक वजन दवाओं 7 वितरित करने के लिए लागू किया गया है. प्लाज्मिड microRNA-7-व्यक्त की liposomal वितरण फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं 8 में epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर tyrosine kinase अवरोध के प्रतिरोध पर काबू. लक्ष्य करते समयपरिसरों endothelial बाधा पार और interstitium 9 में बहना की संभावना नहीं है क्योंकि संवहनी endothelium, नसों में प्रसव के लिए आवश्यक है. अन्य अंगों की तुलना करके, फेफड़ों की microvasculature से ईसीएस सबसे बड़ी तेज है और उत्सुकतापूर्वक लिम्फ नोड्स और Peyer पैच 9 द्वारा पीछा धनायनित liposome और डीएनए / आरएनए परिसरों, भली. रेट्रो कक्षीय या पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से siRNA के कृंतक मॉडल में नसों में प्रसव भी इस तरह के 50 मिलीग्राम / किग्रा 10 के रूप में उच्च सांद्रता में हानिरहित साबित किया गया है. प्रकाशित साहित्य में cationic liposomes की रचना लिपिड तैयार करने और उनके equimolar अनुपात 11, 12 के आधार पर अलग है. , टीके या विरोधी ट्यूमर उपचार के 13-15 का वितरण प्रोटीन की down-regulation/over-expression को लक्षित किया जाए, vivo में जीन डिलीवरी के लिए cationic liposomes का उपयोग कर संभावित अनुप्रयोगों की एक विस्तृत सरणी है. याद करने के लिए महत्वपूर्णडीएनए / आरएनए सेलुलर झिल्ली बातचीत की दक्षता उत्पन्न परिसरों और झिल्ली लिपिड के बीच युग्मन के आकार के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. यह लक्षित सेलुलर झिल्ली प्रोफाइल को लिपिड संरचना सिलाई एक विशेष सेल प्रकार 6 में अभिकर्मक की उच्च दर में लाभकारी और परिणाम हो सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम लंबे समय तक विशिष्ट siRNA / liposome परिसरों के दोहराया नसों में प्रशासन (लगातार 24 दिनों के लिए हर 72 घंटा,) द्वारा vivo में ITSN-1s के नीचे दस्तक के लिए इस पद्धति विकसित दूसरों 9 और हमें 1, 18 के द्वारा प्रकाशित प…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम सपा को स्वास्थ्य अनुदान R01HL089462 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) | Sigma-Aldrich | D2779 | |
| LiposoFast stabilizer (mini-extruder) | Avestin Inc. | LF-STB | |
| Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore | Avestin Inc. | LFM-50 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8667 | |
| Chloroform | Mallinckrodt Chemicals | 4432-04 | |
| Hank’s balanced salts | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Round-bottom flask | Fisher Scientific | FHB-275-030X | |
| Mouse siRNAITSN – on target | Dharmacon/ThermoScientific | J-046912-11 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | REGLO-CDF digital with RHOO pump head | |
| Ventilator | Hugo Sachs Electronik | NA | |
| Barbital | Sigma-Aldrich | B-0500 | |
| Uranyl acetate | EM Sciences | 22400 | |
| Epon812 | EM Sciences | Discontinued by the manufacturer | |
| Propylene oxide | EM Sciences | 20400 | |
| Embedding molds | EM Sciences | 69923-05 | |
| Tannic acid | EM Sciences | 21710 | |
| 8 nm gold-albumin tracer | Prepared in the laboratory as in16 | ||
| Comments | |||
| Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1) | |||
| Pyrex, 100 ml | |||
| Modified siRNA, in vivo | |||
| Part of IDEX corp. | |||
| D-79232 March, Germany | |||
| Replaced with Embed812, cat. # 14120 |
References
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