Målrettet-esterase induceret farvestof belastning (TED) støtter analysen af intracellulære calcium butik dynamik ved fluorescens billeddannelse. Fremgangsmåden baserer på målretning af en rekombinant carboxylesterase til det endoplasmatiske reticulum (ER), hvor det forbedrer den lokale demaskering af syntetisk lav-affinitet Ca<sup> 2 +</sup> Indikatorfarvestoffer i ER lumen.
Visualisering af calcium dynamik er vigtigt at forstå betydningen af calcium i cellefysiologi. At undersøge calcium dynamik, har syntetiske fluorescerende Ca2 + indikatorer blive populær. Her viser vi TED (= målrettet-esterase induceret farvestof lastning), en metode til at forbedre frigivelsen af Ca2 + indikatorfarvestoffer i ER lumen af forskellige celletyper. Til dato, blev TED anvendt i cellelinjer, gliaceller og neuroner in vitro. TED baser på effektiv, rekombinant målretning af høj carboxylesterase aktivitet til skadestuen lumen ved hjælp vektor-konstruktioner, der udtrykker Carboxylesterases (CES). De seneste TED vektorer indeholder et centralt element i CES2 fusioneret til et rødt fluorescerende protein, og dermed gør det muligt samtidig tofarvet billeddannelse. Dynamikken i frit calcium i ER afbildes i én farve, medens det tilsvarende ER struktur vises i rødt. Ved begyndelsen af proceduren, celler transduceret med en lentivirus. Efterfølgende de inficerede celler enre podet på dækglas til endelig muliggøre levende celler. Derefter levende celler inkuberes med acetoxymethylester (AM-ester) form af lav affinitet Ca 2 + indikatorer, fx Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM eller Mag-fura2-AM. Esterase aktivitet i ER spalter off hydrofobe sidekæder fra AM form Ca2 + indikator og en hydrofil fluorescerende farvestof / Ca2 + borkompleks og fanget i ER lumen. Efter farvestof lastning, cellerne analyseres ved en inverteret konfokal laser scanning mikroskop. Celler løbende perfuseres med Ringer-lignende løsninger, og de ER calcium dynamik direkte visualiseres ved time-lapse billeddannelse. Calcium frigivelse fra ER er identificeret ved et fald i fluorescensintensitet i regioner af interesse, hvorimod påfyldning af ER calcium butikken frembringer en stigning i fluorescensintensitet. Endelig er ændringen i fluorescerende intensitet over tid bestemmes ved beregning af bf / F 0.
For at løse fysiologiske calcium svarene fra ER, vi udviklet en ny strategi for at forbedre fældefangst af syntetiske calcium følsomme farvestoffer ind på skadestuen. Metoden gør det muligt direkte, ikke-forstyrrende realtidsovervågning af frit ER calcium i overværelse af ekstracellulært calcium.
Funktion og signalering af ER Calcium
Calcium-signaler findes i forskellige celletyper, fx muskel-celler, neuroner og gliaceller og deres funktioner spænder fra mediere muskelsammentrækning til en involvering i synaptisk transmission i indlæring og hukommelse 1,2. Ændringer i fri calciumkoncentration er af høj videnskabelig interesse, fordi calcium er involveret i reguleringen af gentranskription, celledeling, neuronal uro, celledød og andre celle signalering begivenheder 1-7. Alle disse cellulære calcium signaler er funktionelt forbundet og bidrager til intracellulær calciumbutik dynamik 8-10.
Et fælles træk blandt alle calcium signaler er strømmen af calcium mellem det ekstracellulære rum, cytosolen og organeller, hovedsagelig ER og mitokondrier. Dette forårsager dynamiske ændringer i calciumkoncentration i disse organeller, som afføles af forskellige signalsystemer komponenter. I almindelighed, calciumkoncentrationen i ER svinger mellem 100-800 uM i cytosolen calciumkoncentrationen er tæt på 100 nM, og i det ekstracellulære rum koncentrationen er omkring 1-2 mm. Følgelig er der er en høj kemisk drivkraft for calcium strømme mod cytosolen 2,9,10.
De mest almindeligt undersøgte ER-afledte calcium signaler afhænger stimulering af G-protein-koblede receptorer (GPCR), som derefter aktiverer phospholipase C (PLC). PLC gengæld producerer inositol 1,4,5-triphosphat (IP3) 1.. Efter binding af IP3 til sin receptor (IP 3-Rec, figur 1) i ER-membranen er calciumioner frigøres fra ER lumen. Historisk, IP3-medieret calciumfrigivelse fra ER var første – selvom indirekte – målt i acinar pancreasceller ved Streb m.fl. i 1983 11… Denne publikation foreslået for første gang en signaleringskaskade involverer acetylcholin, phospholipase C, og IP3. På denne måde af calcium frigivelse generelt betegnes IP 3-induceret calcium frigivelse (IiCR) (Figur 1). Kinase-afhængig aktivering af phospholipase Cy ved receptor tyrosin kinaser links virkningen af vækstfaktorer og neurotrofiske faktorer til ER calcium signalering efter IP 3 elevation 12.. Ud over IiCR, kan calcium elevation være medieret af ionotropisk calcium-indtrængningen, fx via spændingsstyrede calciumkanaler (Ca V) og efterfølgende calcium-induceret calcium frigivelse (CICR) ved ryanodine receptors (Ryr). IiCR og CICR er fysiologisk bundet til butik-opererede calcium-indtrængningen (SOCE). SOCE omfatter virkningen af STIM (stroma interagerende molekyle), som er en sensor for ER calcium frigivelse. STIM har vist sig at stimulere ekstracellulært calcium-indtrængningen gennem forbigående receptor potentielle kanaler (Trp) 13, Orai calciumkanaler 14 og endda spænding kalciumkanaler 15 (figur 1). Tab af ER calcium dynamisk reddet af virkningen af Sarco-endoplasmatiske reticulum calcium ATPase (SERCA), som aktivt pumper calcium tilbage ind på skadestuen. Blokering af SERCA med lægemidler såsom thapsigargin afslører en kontinuerlig tab af ER calcium til den cytosoliske rum. Dette ER calcium "lækage" er forårsaget af ER intramembrane pore komplekser såsom Sec61 protein kompleks 16,17 (fig. 1).
I 1998 offentliggjorde Berridge en model, "neuron inden en neuron model", which foreslår et princip fysiologisk rolle for ER i at integrere neuronal calcium 5.. Denne model anser eksistensen af et kontinuerligt ER membran-system danner en intracellulær "billede" af neuronale plasmamembranen 5.. Denne binære eukaryot membran system blev hævdet at være en grundlæggende forudsætning for tidslige og rumlige integration af hurtige og langsomme calcium signaler i neuroner. Calcium-signaler, der opstår enten samtidig eller senere i forskellige pigge eller dendritter af samme neuron tillægges til cellens soma eller kerne via ER, hvor de opsummerede 5,18. Derefter kan deres sum have indvirkning på, ophidselse af neuron, regulering af gentranskription eller integration af signalleringskaskader. Således ER støtter integrationen af calcium-signaler. En forudsætning for dette koncept er kontinuitet ER i en enkelt celle, som er blevet hævdet af flere undersøgelser, og som er blevet bevist i det mindste for somato-dendritic områder og kort afstand axonale fremspring 19-21. Om der er ER kontinuitet i lange axonale fremskrivninger er et spørgsmål om forhandling.
Strategier til at måle strømmen af fri calcium over-membranen
Calcium signaler hyppigst overvåges i cytosolen 22,23. Derfor kan det ikke let kan skelnes om Ca2 + strømmer ind i cytosolen fra ekstracellulære eller fra intracellulære lagre 6,24. For at overvinde denne begrænsning, har metodiske strategier for direkte ER calcium imaging blevet udviklet. Sammenfattende er de følgende strategier anvendt: (1) ER-målrettet gensplejsede protein-indikatorer 25-27 Protein-baserede lav affinitet Ca2 + indikatorerne bioluminescerende protein aequorin eller GFP i kombination med en kalciumfølende protein.. Disse gensplejsede Ca2 + indikatorer (GECIs) kanmålrettes til skadestuen ved hjælp af et signal-peptid og er aktivt holdt i ER ved hjælp af en tilbageholdelse og genfinding motiv. Fælles ER Ca 2 + indikatorer base på Cameleon princip og er Cameleon YC4.3 26,28, Cameleon split YC7.3ER 29 og Cameleon D1 30. (2) Direkte esterase-baserede farvestof lastning af AM-ester med lav affinitet Ca 2 + indikatorer 31,32. AM-derivater af indikatorfarvestoffer (Mag-fura2-AM, Mag-Fluo4-AM eller Fluo5N-AM) passere biologiske membraner i en lipofil, calcium-ufølsomme tilstand. Derefter, i cytosolen samt i ER, frigiver endogene esteraser spalter i AM-estergruppen og Ca2 + indikator, efterlader en vis mængde aktiv farvestof i cytosolen og i ER. Derfor er denne fremgangsmåde nyttig under betingelser med en høj calciumkoncentration i ER, så længe den cytosoliske calciumkoncentration forbliver godt under debeskyttelse grænse for lav-affinitet indikatorer, især under karakteristiske calcium signaler (fx nM til lave uM). (3) AM-ester belastning i kombination med plasma membranpermeabilisering 32.. Tiloversbleven cytosolisk Ca2 + indikator fjernes ved plasma membranpermeabilisering med små mængder af en "mild" rengøringsmiddel (fx saponin) i en kunstig intracellulær puffer. Således kan intracellulære membraner stimuleres, f.eks med IP3 i den intracellulære puffer, direkte gennem "porer" i plasmamembranen. (4) Dialyse af cytosolen under helcelle-konfiguration og samtidige målinger af Ca 2 + i ER lumen og cytosolen 32,33. En celle først fyldt med en lav-affinitet Ca2 +-indikator (f.eks Mag-fura2- AM, ratiometrisk, UV-lys). Bagefter, med hjælp af et plaster pipette resterende CYTosolic lav-affinitet Ca2 + indikator dialyseres ud af cytosolen med en buffer indeholdende en høj affinitet Ca2 +-indikator (f.eks Fluo-3, synligt lys). Denne strategi muliggør samtidig optagelse af cytosoliske og ER afledte signaler. (5) Målrettet-esterase-induceret farvestof loading 8,34. En carboxylesterase (CES) er målrettet til lumen af ER og giver en høj esteraseaktivitet til effektiv indfangning af AM-ester form af lav-affinitet Ca2 + indikatorer.
Målrettet-esterase induceret farvestof belastning (TED)
At forbedre målretning af lav-affinitet Ca2 + indikatorer til skadestuen lumen blev TED udviklet. TED kræver overekspression af en ER målrettet mus carboxylesterase (CES2) (figur 2), som opnås ved ekspressionskonstruktioner. Celler, som udtrykker en rekombinant CES-konstrukt inkuberes med AM-ester form af et calcium idikatoren farvestof (Fluo5N-AM, figur 2). Derefter, i ER er farvestoffet omdannes til Ca 2 + følsom, membran uigennemtrængelig Ca2 + indikator kompleks (Fluo5N/Ca 2 +) af den høje esteraseaktivitet, derfor fange farvestoffet i en høj koncentration i ER lumen 8 , 34.. Metoden er specielt anvendelig til at undersøge ER calcium-release via IiCR-veje for eksempel via metabotropiske, purinerge-eller glutamat receptorer 8,34 og at visualisere ER calcium udtømning via "lække kanaler" direkte, for eksempel efter blokade af SERCA 17 , 34.. Til vores erfaring med lav affinitet Ca 2 + indikator Fluo5N-AM er i øjeblikket den bedste tilgængelige indikator til brug sammen med TED farvestoffet loading strategi. Fluo5N-AM har en lav affinitet til Ca 2 + (dissociationskonstant KD ~ 90 pM, figur 2), er næsten ikke-fluorescerende i sin AM-formen, men giver høj fluorescensemission ved Calcium binding 8,34. Den Fluo5N/Ca 2 + kompleks kan exciteres med en standard lyskilde ~ 490 nm, hvilket svarer til standard farvestoffer, såsom FITC, Alexa 488, eller eGFP. Cytosoliske calcium signaler næppe nå en koncentration i det lave uM rækkevidde og derfor næppe påvises ved Fluo5N i cytosolen 35..
At forbedre TED ydeevne blev adskillige rekombinante vektorkonstruktioner udviklet (figur 3). Oprindeligt er TED vektorer baseret på den kodende sekvens af CES2 (RefSeq accession nummer NM_145603, CES2c) og bedste TED ydeevne observeres med stabil ekspression af CES konstruktioner. Nye TED vektorer udtrykker et centralt element i CES2 fusioneret med rød fluorescens protein TagRFP-T2 36. Disse vektorer har den fordel, at de kan anvendes til at identificere transducerede celler og til at bruge den røde fluorescens som en intern kontrol til normalisering af ændringer i Fluo5N/Ca 2 + fluorescens. Den røde fluorescens også giver mulighed for at visualisere den strukturelle fordeling af ER og ændringer i ER dynamik under stimulering betingelser.
De fordele og ulemper ved TED metoden er blevet drøftet indgående i de seneste publikationer 34,35. Sammenlignet med andre ovenfor beskrevne fremgangsmåder, TED omgår problemet med at forstyrre og perfusion af cellerne. Desuden to aspekter skal fremhæves. Princippet om TED for ER calcium billeddannelse kræver (1..) Den målrettede ekspression af en aktiv carboxylesterase i ER lumen ved hjælp af TED vektorkonstruktioner og (2). Effektiv og præferentielle frigivelse af lav-affinitet syntetiske AM-estere…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er blevet støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 og Friedrich-Baur-Stiftung. Vi vil gerne takke Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories ved University of California, San Diego for at give os Tag-RFP-T2. Vi heldigvis erkender David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, og Didier Trono, University of Geneva, Genève, for at give os den lentivirale plasmider FUGW og psPAX2/pMD2.G.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
Ham’s F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
Materials | |||
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006 | ||
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. |