대상 - 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드 (TED)는 형광 이미징에 의해 세포 내 칼슘 저장소 역학의 분석을 지원합니다. 방법은 합성 낮은 친화력 CA의 로컬 폭로을 향상 소포체 (ER)로 재조합 Carboxylesterase의 대상에 기지 2 +에 표시 염료.
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이 논문에서
요약
초록
칼슘 역학의 시각화 세포 생리학에서 칼슘의 역할을 이해하는 것이 중요합니다. 칼슘 역학을 조사하기 위해, 합성 형광 칼슘 2 +의 indictors가 인기를 끌고있다. 여기에 우리가 TED (= 대상 - 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드), 칼슘의 방출을 개선하는 방법을 보여 + 다른 세포 유형의 ER 루멘의 표시기 염료. 지금까지 TED는 세포 라인, glial 세포 및 생체 뉴런에 사용되었다. 벡터 구조를 사용하여 ER 루멘에 높은 carboxylesterase 활동의 대상으로 효율적인 재조합에 TED 기지가 표현 Carboxylesterases (CES). 최근 TED 벡터 따라서 동시에 두 색 이미징을 가능하게 빨간색 형광 단백질에 융합 CES2의 핵심 요소가 포함되어 있습니다. 해당 ER 구조가 빨간색으로 표시되는 동안 ER 무료 칼슘의 역학은 하나의 색상에서 몇 군데 있습니다. 프로 시저의 시작 부분에서, 세포 렌티 바이러스로 형질 있습니다. 그 후, 감염된 세포다시 마지막 라이브 셀 이미징을 사용하는 coverslips를에 놓는. 그런 다음, 살아있는 세포가 아세 톡시 메틸 에스테르 (AM-에스테르) 낮은 친화력 칼슘의 형태로 배양하는 + 지표, 예를 들어 Fluo5N-AM, 매기 - Fluo4-AM, 또는 매기 - Fura2-AM. 칼슘 2 + 지표 및 친수성 형광 염료 / CA 2 + 복합 AM 양식에서 소수성 측쇄 오프 응급실 클리브의 에스테르 가수 분해 효소 활동이 형성된 ER 루멘에 갇혀있다. 염료로드 후, 세포는 거꾸로 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에서 분석됩니다. 세포는 지속적으로 벨소리와 같은 솔루션을 관류와 ER의 칼슘 역학 시간 경과 영상으로 직접 시각화 수 있습니다. ER의 칼슘 저장소의 보충이 형광 강도의 증가를 생산하는 반면, ER에서 칼슘 방출은 관심 영역에서 형광 강도의 감소에 의해 식별됩니다. 마지막으로, 시간이 지남에 따라 형광 강도의 변화는 ΔF / F 0의 계산에 의해 결정됩니다.
서론
ER의 생리적 칼슘 반응을 해결하기 위해, 우리는 ER로 합성 칼슘에 민감한 염료의 트래핑을 개선하기 위해 새로운 전략을 개발했다. 이 방법은 세포 외 칼슘의 면전에서 무료 ER 칼슘의 직접, 무중단 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.
ER 칼슘의 기능 및 신호
칼슘 신호는 다른 세포 유형, 예를 들면 근육 세포, 뉴런과 학습과 기억 1,2에서 시냅스 전달에 관여로 근육 수축을 중재에서 glial 세포와 그 기능 범위에 있습니다. 칼슘은 유전자 전사, 세포 증식, 신경 흥분, 세포 죽음 및 이벤트 1-7 신호를 다른 세포의 조절에 관여되어 있기 때문에 무료로 칼슘 농도의 변화는 높은 과학적 관심이다. 이러한 모든 세포 칼슘 신호는 기능적으로 연결되어 있고 칼슘을 세포 내에 기여하는매장 역학 8-10.
모든 칼슘 신호 사이의 일반적인 기능은 세포 공간과 칼슘의 흐름, 세포질 및 세포 소기관, 주로 ER 및 미토콘드리아이다. 이 서로 다른 신호 구성 요소에 의해 감지되는 이러한 세포 소기관 내 칼슘 농도의 동적 변경을 발생합니다. 일반적으로 100-800 μM 사이 ER....
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프로토콜
이 프로토콜은 TED 세포 라인, 해마 뉴런과 대뇌 피질의 glial 세포에 적용 소개합니다. TED 성능이 가장 TED 벡터를 안정적으로 렌티 바이러스 벡터에 의해 예를 들어, 표현됩니다. TED 방법의 개략도는 그림 4에 표시됩니다.
1. 솔루션의 준비
다음과 같은 솔루션을 시작하기 전에 준비해야하며, 표시된대로 저장할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 멸균 유리와 플라스틱 소재 및 압력 가마로 소독 한 물을 사용합니다.
- 125 염화나트륨, 3 KCl을, 25 HEPES, 2 황산 마그네슘 0.7 H 2 O 2, 염화칼슘, 1.25 2 PO 4 NaH를 H 2 O, 10 glucose.H 2 O :. HEPES-벨소리를 (mm 단위)를 준비 127 염화나트륨, 3 KCl을, 25 HEPES, 2 황산 마그네슘 0.7 H 2 O, 1.25의 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2....
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결과
이 프로토콜은 무료 ER 칼슘의 직접 이미징을위한 무중단 방식을 제공합니다. 낮은 친화력 합성 칼슘 2 + 지표 발표하고 대상 ER의 도움으로 재조합 에스테르 가수 분해 효소 효소의 활동과 ER 루멘에 갇혀있다. ER 루멘 칼슘 2 + 지표 염료의 향상된로드는 ER의 칼슘 저장소 역학의 직접적이고 빠른 영상을 가능하게합니다.
TED에 대한 세포 유형
방법의 타당성은 셀 라인 BHK21, HEK293 34, 헬라 17, SH-SY5Y 배양 성상 8,40 및 기본 해마와 대뇌 피질의 뉴런 8,34,41에 표시되어 있습니다. 우리의 실험에서, TED는 상대적으로 약한 발기인 (예를 들어 유비퀴틴 프로모터) 35를 사용하여 자체 운영을 중지 렌티 바이러스 벡터 37,39에
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토론
TED 방법의 장점과 단점은 최근의 출판물 34,35에서 광범위하게 논의되었다. 위에서 설명한 다른 방법에 비해, TED는 세포를 방해하고 관류의 문제를 우회. 또한, 두 가지 측면이 강조 될 필요가있다. ER 칼슘 이미징을위한 TED의 원리는 TED 벡터 구조의 도움과 낮은 친화력 합성 AM-에스테르 (2). 효율적이고 특혜 릴리스 ER 루멘의 활성 carboxylesterase (1). 대상으로 표현해야합니다 ER 루멘 칼슘 염료.
1. TED 벡터 생성
그림 3은 TED 벡터 구조의 발전을 요약 한 것입니다. TED는 CES 가족 단백질 (EC 3.1.1.1)에 기초하여 개발되었다. 이 단백질은 ER 루멘의 구성원 거주. 체외에서 들어 CES 단백질의 재조합 관리가 안정적으로 발현 한 후 가장 적합한 연구단백질이나 중간 발현 수준의 바이러스 감염 후. 현재, .......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1와 프리드리히 바우어 - 재단의 보조금에 의해 지원되었다. 우리 태그 - RFP-T2를 저희에게 제공하기 위해 캘리포니아 샌디에고 대학의 로저 Y. 첸 교수, 하워드 휴즈 의학 연구소의 연구소에 감사드립니다. 우리는 다행히도 우리에게 렌티 바이러스 플라스미드 FUGW를 제공하고 psPAX2/pMD2.G 데이비드 볼티모어, 캘리포니아 공과 대학교, 패서 디나, 그리고 디디에 Trono, 제네바, 제네바, 대학을 인정합니다.
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재료
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| B-27 보충제,50x | 인비트로젠 | 17504-044 | |
| 카르바모일콜린 클로라이드 (차르바콜) | 시그마 | C4382-1g | |
| 시클로피아존산 (CPA) | 어센트 사이언티픽 | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| 태아 송아지 혈청 | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ g | Invitrogen | F14204 | |
| 글루타메이트 | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham's F12 영양소 혼합물 | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank's BSS(1x) without Ca, without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-Ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
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참고문헌
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calci....
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