La formación del epitelio prostático humano utilizando tejido recombinación de roedores Urogenital mesénquima seno y células madre humanas
Summary
Para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la próstata primeros sistemas innovadores modelos humanos y enfoques cáncer de iniciación, la novela y se necesitan desesperadamente. El potencial de pre-prostática seno urogenital mesénquima (UGSM) para inducir a las poblaciones de células madre pluripotentes para formar el epitelio de próstata humano es una poderosa herramienta experimental en la investigación de próstata.
Abstract
Los avances en la investigación del cáncer de próstata es muy limitada por la disponibilidad de sistemas de modelos de origen humano y de la hormona-naïve, que limitan nuestra capacidad de entender los eventos genéticos y moleculares que subyacen a la próstata inicio de la enfermedad. Hacia el desarrollo de mejores sistemas modelo para el estudio de la carcinogénesis de próstata humano, nosotros y otros han aprovechado la única potencial inductivo pro-prostática de embriones de roedores estroma prostático, denominada seno urogenital mesénquima (UGSM). Cuando se recombina con ciertas poblaciones de células pluripotentes tales como células madre embrionarias, UGSM induce la formación de epitelio humano normal de la próstata de una manera dependiente de la testosterona. Este sistema modelo humano puede utilizarse para investigar y probar experimentalmente la capacidad de los candidatos genes de susceptibilidad al cáncer de próstata a un ritmo acelerado en comparación con los estudios típicos de roedores transgénicos. Dado que las células madre embrionarias humanas (hESCs) pueden ser modificadas genéticamente en la cultura using de expresión génica inducible o siRNA vectores knock-down antes de la recombinación tejido, tal modelo facilita la prueba de las consecuencias funcionales de los genes, o combinaciones de genes, que se piensan para promover o impedir la carcinogénesis.
La técnica de aislar poblaciones puras de células UGSM, sin embargo, es un reto y el aprendizaje a menudo requiere alguien con experiencia anterior para enseñar personalmente. Por otra parte, la inoculación de mezclas de células bajo la cápsula renal de un huésped inmunocomprometido puede ser técnicamente difícil. Aquí describimos e ilustramos el aislamiento adecuado de UGSM a partir de embriones de roedores y renal implantación cápsula de mezclas de tejidos para formar el epitelio prostático humano. Este enfoque, en su fase actual, requiere xenoinjerto in vivo de las células madre embrionarias; aplicaciones futuras podrían incluir potencialmente en la formación de la glándula o el uso in vitro de poblaciones de células madre pluripotentes inducidas (iPS).
Introduction
Hay una tremenda necesidad de mejores sistemas de modelos humanos de cáncer de próstata. En particular, sistemas de modelos humanos pertinentes de tejidos de próstata normales, no malignas que pueden ser manipuladas genéticamente para discernir directamente el papel de genes específicos en la iniciación del cáncer de próstata serían muy informativo. El advenimiento de la era genómica ha identificado numerosos genes que pueden tener un papel en la formación del cáncer. La falta de sistemas de modelos experimentales humanos, sin embargo, perjudica gravemente nuestra capacidad para probar y caracterizar funcionalmente genes candidatos de susceptibilidad al cáncer de próstata. Un sistema modelo ideal sería facilitar los análisis funcionales rápidos y más rápida de genes de susceptibilidad al cáncer en combinación con sistemas de modelos de roedores transgénicos adecuados. Por otra parte, un sistema modelo humano tal permitiría la caracterización molecular de los mecanismos de señalización de la carcinogénesis de próstata hacia el descubrimiento y validación de nuevas terapias paraevitar la formación de cáncer de próstata.
Células madre embrionarias humanas (hESCs) son capaces de formar los tejidos prostáticos humanos como xenoinjertos. En 2006 Taylor, et al. Informó que hESCs pueden ser inducidas a formar epitelios de próstata in vivo cuando se re-combinado con roedores seno urogenital mesénquima (UGSM) dentro de un período de tiempo de 8-12 semanas. 1 Estos estudios se basaban en el trabajo previo de el laboratorio Cunha que muestra que roedores UGSM embrionario puede promover la diferenciación de las células madre de próstata y poblaciones de células epiteliales embrionarias in vivo. 2,3 La próstata se desarrolla a partir de un Anlagen embrionario denominado el seno urogenital (UGS), y antes de que el día embrionario 17 (E17 ratón ; día E18 en la rata) el UGS se pueden quitar y divididos físicamente en el epitelio (UGSE) y el mesénquima (UGSM) 4 Este enfoque recombinación tejido ha mejorado significativamente nuestra comprensión del desarrollo y la carcinogénesis de próstata, en particular.factor de crecimiento de LY y vías de señalización hormonales y las relaciones moleculares entre la próstata estroma y el epitelio. 5-8 Este método implica la combinación ex vivo de UGSM con tallo o células epiteliales de las mismas o distintas especies y estos recombinantes celulares / tejido se implantan y se cultivaron y xenoinjertos en ratón huésped. 4,9 Después de un período de crecimiento in vivo, el implante contiene próstata estructuras glandulares epiteliales incrustados en el tejido del estroma. Además tinción puede llevarse a cabo para determinar si tales estructuras son verdaderamente prostática y de origen humano. 10,11
Protocol
Representative Results
Discussion
Tejido por medio de recombinación UGSM es una técnica muy útil para investigar el desarrollo de la próstata y los eventos moleculares que conducen a la iniciación del cáncer de próstata. El potencial inductivo de UGSM se ha utilizado en numerosas aplicaciones en la investigación de próstata, que incluyen la mejora del tumor toma de líneas celulares de próstata y tumores, el estudio de las interacciones epiteliales del estroma-, y la formación de recombinantes de próstata de especies cruzadas 7,17-20</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer el apoyo de la Universidad de Chicago Sección de Urología dirigido por el Dr. Arieh Shalhav, y el Director de Investigación Urológica Dr. Carrie Rinker-Schaeffer. También nos gustaría agradecer el apoyo de la Universidad del Centro Integral del Cáncer de Chicago (UCCCC), dirigido por la Dra. Michelle Le Beau. También dar las gracias a la asistencia técnica de expertos de la instalación Human Tissue Resource Center básico dirigido por el Dr. Mark Lingen, y la ayuda de Leslie Martin y Mary Jo Fekete. También agradecemos a la facilidad de la base inmunohistoquímica dirigido por Terri Li. Este trabajo fue financiado por la Universidad del Departamento de Cirugía de Chicago, la Sección de Urología, la Sociedad Americana del Cáncer Beca de Investigación Institucional (ACS-IRG, # IRG-58-004), un Centro del Cáncer de Apoyo Grant (P30 CA14599); El Brinson Fundación, el Fondo Alvin Baum Familia, la Universidad de Chicago Board Cancer Research Foundation de la Mujer; S. Kregel el apoyo de un HHMI: Med-en-Grad becarioscadera (56006772) y Biología del Cáncer Training Grant (T32-CA09594). Por último, nos gustaría dar las gracias a Robert Clark, Dr. VenkateshKrishnan y Nathan Stadick para su evaluación crítica del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
References
- Taylor, R. A., et al. Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).
- Cunha, G. R., Chung, L. W. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).
- Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions. Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).
- Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. Mouse urogenital development: a practical approach. Differentiation. 71, 402-413 (2003).
- Cunha, G. R., et al. Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors. J. Androl. 13, 465-475 (1992).
- Cunha, G. R., et al. Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract. World J. Urol. 13, 264-276 (1995).
- Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation. Differentiation. 65, 113-118 (1999).
- Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development. Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).
- Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues. Differentiation. 24, 174-180 (1983).
- Van der Griend, D. J., et al. The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells. Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).
- Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. , (2009).
- Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. 69, 1557-1564 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).
- Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).
- Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues. Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).
- Wang, Y. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis. Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).
- Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Yu, X. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).
- Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy. Retrovirology. 3, 24 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).
