في الوقت الحقيقي التصوير من التفاعلات صفائح الدم، العدلات غيروي على البطانة الوعائية التهاب المنشط خلال تشكيل خثرة في والفئران الحية
Summary
نحن هنا نورد التجريبي لتقنية المجهر مضان intravital لتصور غيروي الصفائح الدموية العدلات التفاعلات على البطانة الوعائية التهاب تنشيط خلال تشكيل خثرة في والفئران حية. وهذه التكنولوجيا المجهرية تكون ذات قيمة لدراسة الآلية الجزيئية لأمراض الأوعية الدموية وكلاء الدوائية لاختبار في ظل ظروف المرضية في جسم المريض.
Abstract
تفاعل الصفائح الدموية المنشط والكريات البيضاء (العدلات في المقام الأول) على تخثر البطانة يتوسط المنشط والتهاب الأوعية الدموية. 1،2 خلال تشكيل خثرة في موقع الإصابة شريني، الصفائح الدموية تمسكا البطانة تنشيط والبروتينات المصفوفة تحت البطانة دعم المتداول العدلة والتصاق .. 3 وعلى العكس، في ظل ظروف التهابات venular، يمكن العدلات تمسكا البطانة تنشيط دعم التصاق وتراكم الصفائح الدموية في الدورة الدموية. غيروي الصفيحات التجميع العدلات، يتطلب عمليات متسلسلة من التفاعلات المحددة مستقبلات مستقبلات المضادة بين الخلايا .. 4 ومن المعروف أن الخلايا البطانية المنشط الإفراج جزيئات الالتصاق مثل عامل فون ويلبراند، وبالتالي الشروع التصاق الصفائح الدموية وتراكمها في ظل ظروف ارتفاع القص .. 5 أيضا، تنشيط الخلايا البطانية دعم المتداول العدلة والتصاق من إبداء selectinsد جزيء التصاق بين الخلايا-1 (ICAM-1)، على التوالي، في ظل ظروف القص منخفضة .. 4 صفائح الدم P-selectin يتفاعل مع العدلات من خلال P-selectin سكري يجند-1 (PSGL-1)، الأمر الذي أدى بالتالي تفعيل العدلات من integrins β2 وشركة التصاق بين أنواع الخلايا اثنين. على الرغم من التقدم في المختبر في التجارب التي يتم فيها تحديد غيروي الصفائح الدموية في الدم التفاعلات العدلات كليا أو الخلايا المعزولة، 6،7 يمكن التلاعب تلك الدراسات لم ظروف الإجهاد الناتج عن الأكسدة أثناء أمراض الأوعية الدموية. في هذا التقرير، وذلك باستخدام fluorescently التي تحمل علامات، والأجسام المضادة محددة ضد ماوس الصفائح الدموية وعلامة العدلات، ونحن تصف بروتوكول مفصلة لمراقبة مجهرية intravital التفاعلات غيروي من الصفائح الدموية والعدلات على البطانة تنشيط TNF-α خلال الناجم عن التهاب أو بعد الليزر التي يسببها إصابة في العضلة المشمرة microvessels من الفئران الحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة للفحص المجهري في الوقت الحقيقي intravital مضان لتصور غيروي الصفائح الدموية العدلات التفاعلات على البطانة الوعائية التهاب تنشيط أثناء وتجلط الدم. سابقا، تم الإبلاغ عن نهج مماثلة المجهرية مضان لدراسة الآلية الجزيئية لتشكيل خثرة والتهاب الأوعية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (P30 HL101302 وRO1 HL109439 لJC) وجمعية القلب الأمريكية (SDG 5270005 لJC). وأيد A. Barazia من منحة المعاهد الوطنية للصحة T32HL007829 التدريب.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| ROE-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
