Måling av glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) er gullstandarden for nyrefunksjonen vurdering. Her beskriver vi en high-throughput fremgangsmåte som tillater bestemmelse av GFR i bevisste mus ved hjelp av en enkelt bolusinjeksjon, bestemmelse av fluorescein-isothiocyanat (FITC)-inulin i plasma og beregning av GFR av en to-fase eksponentiell modell.
Måling av glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) er gullstandarden i nyrefunksjonen vurdering. Foreløpig undersøkere bestemme GFR ved å måle nivået av endogent eller eksogent biomarkør kreatinin anvendt radioaktivt merket inulin (3 H, eller 14 C). Kreatinin har betydelig ulempe at proksimale tubulære sekresjon utgjør ~ 50% av total renal kreatinin i nyrene, og derfor kreatinin er ikke en pålitelig GFR markør. Avhengig av resultatene av eksperimentet, kan inulin clearance bestemmes ved en intravenøs enkelt bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon (intravenøs eller osmotisk minipump). Begge tilnærminger krever innsamling av plasma eller plasma og urin, henholdsvis. Andre ulemper med radioaktivt merket inulin omfatte bruk av isotoper, tidkrevende kirurgiske forberedelse av dyrene, og kravet til en terminal eksperiment. Her beskriver vi en fremgangsmåte som anvender en enkelt bolusinjeksjon avfluorescein isothiocyanat-(FITC) merket inulin og måling av fluorescens i dens 1-2 mL fortynnet plasma. Ved å anvende en to-kammer-modellen, med 8 blodprøvetakinger pr mus, er det mulig å måle GFR i opp til 24 mus pr dag ved hjelp av en spesiell arbeidsflytgenerator protokollen. Denne metoden krever bare kort isoflurananestesi med alle blodprøver blir samlet i en ikke-behersket og våken mus. En annen fordel er at det er mulig å følge mus over en periode på flere måneder og behandlinger (dvs. gjør parvise forsøk med kosten endringer eller stoffet applikasjoner). Vi håper at denne teknikken for å måle GFR er nyttige for andre etterforskere som studerer mus nyrefunksjon og vil erstatte mindre nøyaktige metoder for estimering av nyrefunksjonen, slik som plasma kreatinin og blodureanitrogen.
Satsen for dannelse av plasma ultrafiltratet glomerulus har blitt grunnlag for å vurdere nyrefunksjonen (glomerulær filtrasjonshastighet, GFR). Den ideelle markør for å avgjøre GFR bør være fritt filtrert verken skilles eller reabsorberes og ikke metaboliseres. En slik atferd ble funnet å være sant for inulin, og inulin clearance har blitt en gullstandard for bestemmelse av GFR tre. Mens clearance av kreatinin er mye brukt som et mål på GFR hos mennesker og dyr, ikke kreatinin ikke oppfyller kravene til et ideelt GFR markør. Rundt 10-40% av kreatinin-clearance hos mennesker er konsekvensen av aktiv tubulær sekresjon 1, 11, og renal utskillelse av kreatinin er også fremtredende i mus og rotter 4, 7, 9, 22. Renal dysfunksjon er kjent for å øke den rørformede sekresjon av kreatinin noe som begrenser dens verdi som en markør på en GFR, 2.. Vi har tidligere vist at organisk anion transporter isoform3 (OAT3) bidrar til murine nedsatt kreatinin utskillelsen 22. Imidlertid krever inulin klaring typisk bruk av radioaktivt merket inulin (3 H, eller 14 C). Den radioaktive bestemmelse av inulin kan brukes både i bedøvede og bevisste mus, men havner ulempene ved tallrike og strenge sikkerhetsforskrifter håndteringsspørsmål iboende ved bruk av radioaktive isotoper. Langs disse linjene, kirurgiske klaring forberedelsene til bestemmelse av GFR er tidkrevende så vel som terminal i naturen. I 1999 Lorenz et al. 12. innført FITC-inulin som en markør av single nephron GFR i bedøvet mus. Fem år senere Qi et al. 15. bestemmes hel nyre GFR hos våkne mus ved hjelp av FITC-inulin. Alternative protokoller nå bruker FITC-inulin som en eksogen markør for å måle GFR hos våkne og bedøvet mus. Disse protokollene beholde følsomheten av radioaktivt inulin ved hjelp av fluorescens detectipå og omgå ulempene med å jobbe med et radioaktivt merket markør. FITC-inulin analysen ble modifisert av andre syv, åtte og oss 22, 23 for å dra nytte av microvolume evne til NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Dette gjør redusere det totale prøvevolum for å <100 mL blod per GFR måling.
Med fremgangsmåten og høy gjennomstrømning protokollen gitt i denne publikasjonen demonstrerer vi muligheten for måling GFR i opptil 24 bevisste mus pr dag. Denne teknikken kan være nyttig for andre etterforskere som studerer murine GFR og vi håper det vil erstatte mindre nøyaktige metoder som indekser for nyrefunksjon, for eksempel kreatinin og blodureanitrogen.
Foreliggende studie beskriver en teknikk for bestemmelse av GFR i bevisste mus ved enkelt-bolus injeksjon og analyse av fluorescensen i 8 blodprøver ved to-fase eksponensiell desintegrasjon. En GFR måling i en mus tar 75 min. Ved å bruke en spesiell flow-diagram, er det mulig å måle GFR av 6 mus i 130 min. Det er mulig å gjenta dette flytskjema protokollen opp til fire ganger per dag og måle GFR i 24 mus. Vi modifiserte denne metode, slik at det er mulig å samle blod fra en liten hale snip snarere enn halevenen punktering, som er raskere og enklere for undersøkere å utføre i forhold til halevenen punktering. Ved å bruke 10 ul hematokrit kapillærer og en fortynning på 1:10, er det mulig å redusere den totale mengden av blod som er nødvendig for å <100 ul. Til slutt blir fluorescens målt ved hjelp av en NanoDrop 3300 fluorospectrometer, som tillater bestemmelse av fluorescens i 1-2 pl av fortynnede prøven. Denne metoden vil gi den interesserte investigatora sant GFR verdi. I kontrast, kreatinin målinger i mus har flere svakheter, inkludert "kreatinin blind range" og problemer relatert til spesifikke og sensitive besluttsomhet. Den "kreatinin blind range" begrenser dens funksjon som en markør for GFR fordi serum kreatinin forblir i normalområdet inntil 50% av nyrefunksjonen er tapt 19. Siden flere etterforskere utnytte genmodifiserte mus i sin forskning for å studere renal fysiologi og patofysiologi, bærer dette følgende problem: forutsatt en knockout mus av genet X ville ha en betydelig lavere GFR (med 40%) sammenlignet med en vill-type mus, en enkel screening ved å sammenligne plasma kreatinin ville ikke oppdage denne forskjellen. Behovet for en god nøyaktig metode for bestemmelse GFR blir mer kritisk jo mindre forskjellene i GFR bli.
Mus har høye konsentrasjoner av ikke-kreatinin chromagens i sin plasma og urin som forstyrrer kommersielttilgjengelige kreatinin analyser. Som en konsekvens av dette assay som er basert på alkalisk pikrat Jaffe reaksjon overestimate kreatinin-konsentrasjonen i plasma sammenlignet med væskekromatografi med høy ytelse (HPLC) 6 bestemmelse, 13.. En annen begrensning er at serumkreatinin er under påvisningsgrensene for flere kommersielt tilgjengelige analyser i forhold til HPLC-bestemmelse. Men ved hjelp av enzymatiske reaksjoner undersøkere var i stand til å bestemme plasma-kreatinin hos 10 mus, 22..
GFR i et lignende område ble funnet hos bevisste mus ved anvendelse av en tilsvarende enkelt-bolus injeksjon metode samt urin-FITC-inulin klaring 14.. I motsetning til deres fremgangsmåte, ikke vår protokollen med hale klipp krever ikke spesielle forholdsregler for å bevare fartøyet integritet i forhold til halen blodåre eller saphenavene punktering. For urin / plasma basert FITC-inulin clearance er det nødvendig å kirurgisk implantat to osmotisk minipumps. To pumper er nødvendig for å oppnå høy nok steady-state plasma FITC-inulin konsentrasjoner som er klart kan skilles fra bakgrunnen. Dette krever også bruk av metabolske bur for en fullstendig og tidsbestemt urinprøvetakning. Merdene må skylles på kontoen for et tap på 25-37% av FITC-inulin, som ellers skjer uten skylling.
Fallgrubene bruke denne FITC-inulin metoden er begrenset. Etterforskerne skal være oppmerksom på følgende: (i) sikre at det ikke er luftbobler i sprøyten brukes til injeksjon av FITC-løsning, må (ii) komplett retrobulbar injeksjon oppnås fordi mengden injisert bestemmer beregnet GFR, og ( iii) mus vil mest sannsynlig urinere i løpet av 75 min GFR eksperiment, så unngå forurensing av blodprøver med urin, noe som vil ha en meget høy konsentrasjon FITC-inulin som en konsekvens av nyrer konsentrasjon evne.
Generelle fordeler of dette FITC-inulin metode inkluderer følgende: (i) det er en ikke-radioaktiv teknikk, (ii) er det mulig å gjenta målinger flere ganger i den samme mus, (iii) analysen kan utføres i bevisste mus, ( iv) ingen urinprøvetakning er nødvendig, og (v) en high-throughput alternativ kan utnyttes. Ulemper for enkelt bolusinjeksjon omfatter behovet for dialyse av FITC-inulin, som kan overvinnes ved å bruke en bedre FITC-markør, FITC-sinistrin, som er tilgjengelig nå, og kan måles transkutant ved hjelp av en spesiell miniatyrisert ningen 18. Selv om GFR er målt, er det ikke mulig å måle fraksjonelle ekskreter på væske-eller ioner med denne metoden.
Til sammen gir denne metoden gjennomførbarheten av et high-throughput metode for måling av GFR hos våkne mus. Dermed kan denne teknikken være av interesse for andre forskere som er interessert i å bestemme nyrefunksjon hos mus.
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker Dr. Jessica Dominguez rieG for kritisk lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (Forsker Development Grant 10SDG2610034), Carl W. Gottschalk Forskning Grant av American Society of Nefrologi, National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer O'Brien Center for akutt nyreskade Forskning ( P30DK079337), og Department of Veterans Affairs.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |