评估神经退行性表型<em>果蝇</em>爬坡试验和全脑多巴胺能神经元免疫组化染色
Summary
在这里，我们描述了两个实验，已建立了学习年龄依赖性的多巴胺（DA）神经元的神经退行性疾病<em>果蝇</em>：攀登/的惊跳诱导负趋地性试验，允许DA能神经元变性，这是用来识别和计数DA能神经元全脑坐骑酪氨酸羟化酶免疫功能的影响研究。
Abstract
果蝇是一种有价值的模式生物，研究在神经系统的衰老和退行性病理过程。飞作为一个实验系统的优势包括其遗传的可追踪性，寿命短，观察和定量分析复杂的行为的可能性。在特定神经元群体的果蝇脑疾病相关的基因的表达，可以用来模拟人类神经变性疾病如帕金森氏症和阿尔茨海默氏症的5。
多巴胺（DA）神经元是最脆弱的神经元群体在人类大脑的老化。在帕金森氏病（PD），最常见的神经退行性运动障碍，加速多巴胺神经元丢失导致一个渐进的和不可逆的运动功能下降。除了年龄和暴露于环境毒素，加剧了特定的基因突变在编码多巴胺神经元丢失或几个基因的启动子区域的。这样的PD相关的等位基因的鉴定果蝇作为模型来研究神经退行性疾病的DA神经元在体内的利用提供了实验依据。例如，表达的PD联的人α-突触核蛋白基因在果蝇 DA能神经元的概括人类疾病的一些特点， 例如逐步多巴胺神经元丢失和运动功能下降，2。因此，这种模式已经被成功地用于识别潜在的治疗靶点，PD 8。
在这里，我们描述了两个实验，通常被用来研究果蝇 DA能神经元年龄相关的神经退行性疾病：攀岩惊吓引起的负趋地响应和整个成人脑酪氨酸羟化酶免疫的基础上安装检测监控DA能神经元的数量在不同的年龄段。在这两种情况下， 在体内表达的UAS吨ransgenes，特别是在DA能神经元，可以实现使用酪氨酸羟化酶（TH）启动子-Gal4的驱动线3，10。
Introduction
这里描述的检测的特异性依赖于使用的Gal4的利用，以达到特定的多巴胺能神经元中的表达3的酪氨酸羟化酶基因的调节序列的飞线。酪氨酸羟化酶催化的第一和多巴胺合成的限速步骤。 TH免疫反应性在成体果蝇脑中多巴胺，TH一个很好的候选，以确定在体内的多巴胺神经元（见实施例6）重叠。此外，比其他Gal4的线（如DdcGal4），其中包含从多巴脱羧酶基因的调节序列，并驱动转基因的表达不仅在DA能神经元更具体的表达模式THGal4，而且在5 -羟色胺能神经元和神经胶质细胞3的子集。
Feany和德尔（2000）首次观察到泛神经元的PD联的人α-突触核蛋白基因的表达逐渐丧失站加速的诱导rtle的负趋地在果蝇的行为， 我们已经观察到了类似的结果，使用的DA神经元特异性THGal4线驱动expressionof的α-突触核蛋白基因10，使用这个功能读出Nrf2与途径研究的神经保护作用，在此果蝇的PD模型14。使用此处所描述的具体的测定适于从2和3。
果蝇的大脑包含超过100个DA能神经元，安排至少 在5个不同的集群（PPL1 PPL2，PAL，/ 2 PPM1，PPM3）全脑坐骑可以可视化激光共聚焦显微镜（例如11和7）。然而，不论是否在果蝇脑年龄下降，9号，11多巴胺神经元的数目;年龄依赖性的神经退行性疾病中观察到的苍蝇PD-连锁基因已突变/过度人类疾病模型，目前仍有争议5。 DA能神经元中的表达人类α-共核蛋白就有这样的效果，因此，已被用来作为帕金森病的模型。在这里，我们描述了一个检测DA能神经元计数安装使用全脑TH细胞标记。此法是改编自13和10。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的检测提供了一个有用的方法来研究特定基因的作用，信号转导通路或小分子化合物在维护DA能神经元的老化，以及在不同的疾病与遗传背景（5审阅）。
惊跳果蝇行为引起的负趋地性，已被广泛用于作为PD-连锁突变的存在下，特别是在不同的遗传背景中的多巴胺神经元的功能的官能读出。在不同的研究中已观察到一些差异（见12，用于更详细?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
飞股票我们利奥Pallanck感谢，恭索莫斯技术援助和P. Sykiotis耶拉西莫斯有益的讨论。这项工作是由美国国立卫生研究院资助的培训补助T32CA009363 MCB
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) |
Materials Table.
References
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