Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em> Drosophila</em> Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

Summary

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren in<em> Drosophila</em>: Het klimmen / schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis assay waarmee de functionele effecten van DA neuronen degeneratie en tyrosine hydroxylase immunokleuring die wordt gebruikt om DA neuronen in volledige hersenen mounts identificeren en tellen bestuderen.

Abstract

Drosophila melanogaster is een waardevolle modelorganisme om veroudering en pathologische degeneratieve processen te bestuderen in het zenuwstelsel. De voordelen van de vlieg als een experimenteel systeem omvatten de genetische traceerbaarheid, korte levensduur en de mogelijkheid te observeren en kwantitatief analyseren van complexe gedrag. De expressie van ziekte-gebonden genen in specifieke neuronale populaties van de Drosophila hersenen, kan worden gebruikt om menselijke neurodegeneratieve ziekten zoals Parkinson en Alzheimer ⁵ model.

Dopaminerge (DA) neuronen zijn de meest kwetsbare neuronale populaties in het verouderen menselijke hersenen. Bij de ziekte van Parkinson (PD), de meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening, de versnelde verlies van DA neuronen leidt tot een progressieve en onomkeerbare achteruitgang van motorische functie. Naast leeftijd en blootstelling aan giftige stoffen, is het verlies van DA neuronen versterkt door specifieke mutaties in de coderendeof promotorregio's van verschillende genen. De identificatie van dergelijke PD-geassocieerde allelen verschaft de experimentele basis voor het gebruik van Drosophila als een model voor neurodegeneratie van DA neuronen in vivo. Bijvoorbeeld, de expressie van de Parkinson-gerelateerde humane α-synucleine gen in Drosophila DA neuronen recapituleert sommige elementen van de menselijke ziekte, bijv. progressief verlies van DA neuronen en dalende motorische functie ^2. Dienovereenkomstig is dit model met succes gebruikt om potentiële therapeutische targets te identificeren in PD ^8.

Hier beschrijven we twee assays die gewoonlijk zijn gebruikt om leeftijdsgebonden neurodegeneratie van DA neuronen te bestuderen in Drosophila: a climbing assay gebaseerd op het schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis reactie en tyrosine hydroxylase immunokleuring van hele volwassen hersenen zwellend aantal DA neuronen toezicht op verschillende leeftijden. In beide gevallen, in vivo expressie van UAS tspecifiek ransgenes in DA neuronen worden bereikt door een tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver lijn ^{3, 10.}

Introduction

De specificiteit van de assays beschreven gebaseerd op het gebruik van een Gal4 vlieg lijn die de regulerende sequenties van de tyrosine hydroxylase gen specifieke expressie in dopaminerge neuronen ³ bereiken exploiteert. Tyrosine hydroxylase katalyseert de eerste en snelheidsbepalende stap in dopamine synthese. TH immunoreactiviteit in de volwassen vliegen hersenen overlapt met dat van dopamine, waardoor TH een goede kandidaat om DA neuronen in vivo (zie voorbeeld ⁶⁾ te identificeren. Bovendien, het expressiepatroon van THGal4 is specifieker dan andere Gal4 lijnen zoals DdcGal4 die regulerende sequenties bevat van het dopa decarboxylase gen en rijdt transgene expressie niet alleen in DA neuronen, maar ook in serotonerge neuronen en gliacellen subsets van ³ .

Feany en Bender (2000) voor het eerst waargenomen dat de pan-neuronale expressie van het Parkinson-gerelateerde menselijke α-synucleïne gen versnelt het progressief verlies van startle-geïnduceerde negatieve geotaxis gedrag in Drosophila. We hebben soortgelijke resultaten met behulp van de DA-neuron specifieke THGal4 lijn naar de expressionof een α-synucleïne transgen ¹⁰ rijden geobserveerd en gebruikt dit functionele uitlezing aan de neuroprotectieve rol van de Nrf2 pathway in deze studie Drosophila model van PD ^14. De specifieke assay beschreven wordt aangepast van ² en ^3.

De Drosophila hersenen bevatten meer dan 100 DA neuronen, gerangschikt in ten minste 5 verschillende clusters (PPL1, PPL2, PAL, ppm1 / 2, ppm3) die volledige hersenen mounts kan worden gevisualiseerd door confocale microscopie (zie voorbeeld ¹¹ en ^7). Het is nog steeds controversieel of het aantal DA neuronen in de Drosophila hersenen afneemt met de leeftijd ^{9, 11,} maar wordt leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie waargenomen bij vliegen wanneer PD-gebonden genen gemuteerd / overexpressie op menselijke ziekten modelleren5. De expressie van humaan α-synucleïne in DA neuronen heeft zo'n effect en derhalve is gebruikt als een model voor PD. Hier beschrijven we een test voor DA neuronen tellen in hele brein mounts met TH als een cel marker. Deze test is aangepast van ¹³ en ^10.

Protocol

1. Schrikreactie-geïnduceerde Negatieve geotaxis Assay Selecteer vliegen van het gewenste genotype, ze scheiden naar geslacht, willekeurig groeperen ze in cohorten van 20-30 dieren en draai ze in nieuwe voedingsmiddelen flacons om de 2-3 dagen; testen elke set van vliegen (dwz leeftijd gematchte cohorten, een cohort / genotype) minstens een keer per week. Dertig minuten voor de negatieve geotaxis test, verdoven de vliegen met CO 2 en plaats ze in de pre-gelabelde plastic buizen …

Representative Results

We hebben de assays beschreven de rol van de stress beschermende Nrf2 signaalweg in een Drosophila model van PD 14. Dit model is gebaseerd op de expressie van het humane α-synucleine gen in DA neuronen met een TH Gal4 driver 2, 10. Figuur 1 toont een representatief resultaat van een schrikreactie geïnduceerde negatieve geotaxis (klimmen) test bij mannelijke vliegen die verschillende transgenen onder controle van de TH Gal4 driver. Alle getest…

Discussion

De assays beschreven een nuttige benadering van de rol van specifieke genen te bestuderen signaaltransductiewegen of kleine verbindingen in het onderhoud van DA neuronen bij veroudering en verschillende ziekte-gekoppelde genetische achtergronden (beoordeeld in ^5).

De schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis gedrag van Drosophila is uitgebreid gebruikt als een functionele uitlezing voor de functionaliteit van DA neuronen in verschillende genetische achtergronden, vooral …

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
			Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)

Materials Table.