Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em> Drosophila</em> Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining
Summary
Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu studieren<em> Drosophila</em>: Das Klettern / startle-induzierten negativen Geotaxis Assay, um die funktionalen Auswirkungen der DA Neurone Degeneration und der Tyrosinhydroxylase Immunfärbung, die zur Identifizierung und zählen DA Neuronen im gesamten Gehirns Halterungen wird studieren können.
Abstract
Drosophila melanogaster ist ein wertvoller Modellorganismus zur Alterung und pathologischen degenerativen Prozessen im Nervensystem zu studieren. Die Vorteile der Fliege als experimentelles System sind seine genetischen Lenkbarkeit, kurze Lebensdauer und die Möglichkeit zu beobachten und quantitativ zu analysieren komplexe Verhaltensweisen. Die Ausprägung der Krankheitsresistenz-chromosomale Gene in spezifische neuronale Populationen der Drosophila Gehirn, können verwendet werden, um neurodegenerative Erkrankungen wie der Parkinson-und Alzheimer-5 zu modellieren.
Dopaminergen (DA) Neurone gehören zu den am stärksten gefährdeten neuronale Populationen in der alternden menschlichen Gehirns. Bei der Parkinson-Krankheit (PD), die häufigste neurodegenerative Bewegungsstörung, führt der beschleunigte Verlust von DA Neuronen zu einer fortschreitenden und irreversiblen Rückgang der Funktion der Bewegungsorgane. Neben Alter und der Belastung durch Umweltgifte, ist der Verlust der DA Neuronen durch spezifische Mutationen in der kodierenden verschärftoder Promotor-Regionen von mehreren Genen. Die Identifizierung solcher PD-assoziierten Allele liefert die experimentelle Grundlage für die Verwendung von Drosophila als Modell zur Neurodegeneration DA Neuronen in vivo zu studieren. Zum Beispiel, der Ausdruck der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen in Drosophila DA Neuronen rekapituliert einige Merkmale der menschlichen Erkrankung, z. B. progressive Verlust von DA Neuronen und sinkende Bewegungsapparates Funktion 2. Dementsprechend ist dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um potentielle therapeutische Targets in PD 8 zu identifizieren.
Hier beschreiben wir zwei Assays, die üblicherweise verwendet wurden, um altersabhängige Neurodegeneration DA Neuronen in Drosophila untersuchen: a Klettern Assay basiert auf der startle induzierten negativen Geotaxis Reaktion und Tyrosin Hydroxylase Immunfärbung der gesamten erwachsenen Gehirn montiert, um die Anzahl von Neuronen überwacht DA in verschiedenen Altersstufen. In beiden Fällen, in vivo-Expression von UAS transgenes speziell in DA Neuronen durch einen Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Promotor-Gal4 Treiberleitung 3, 10 erreicht werden.
Introduction
Die Besonderheit des hier beschriebenen Assays beruht auf der Verwendung eines Gal4 Fliege Linie, die die regulatorischen Sequenzen der Tyrosin-Hydroxylase-Gen Expression in dopaminergen Neuronen 3 erreichen ausnutzt. Tyrosinhydroxylase katalysiert den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in Dopamin-Synthese. TH-Immunreaktivität in der erwachsenen Fliege Gehirn Überschneidungen mit der Dopamin, was TH ein guter Kandidat, um DA Neuronen in vivo (siehe zum Beispiel 6) zu identifizieren. Darüber hinaus ist die Expression von THGal4 präziser als andere Gal4 Linien wie DdcGal4, die regulatorischen Sequenzen enthält der Dopa-Decarboxylase-Gen und treibt transgene Expression nicht nur in DA Neuronen, sondern auch in serotonergen Neuronen und Gliazellen Teilmengen von 3 .
Feany und Bender (2000) zum ersten Mal beobachtet, dass pan-neuronale Expression der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen den fortschreitenden Verlust von sta beschleunigtrtle-induzierten negativen Geotaxis Verhalten in Drosophila. Wir haben ähnliche Ergebnisse mit dem DA-Neuron-spezifische THGal4 Linie, um die Expression von α-Synuclein eine transgene 10 fahren beobachtet und verwendet diese funktionelle ausgelesen, um die neuroprotektive Rolle des Nrf2-Signalweg in dieser Studie Drosophila-Modell der PD 14. Die spezifischen Assay hier beschriebenen 2 und 3 angepasst.
Die Drosophila Gehirn enthält mehr als 100 DA Neuronen, in mindestens 5 verschiedenen Clustern angeordnet (pPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3), die visualisiert werden in ganze Gehirn Halterungen durch konfokale Mikroskopie können (siehe zum Beispiel 11 und 7). Es ist noch umstritten, ob die Anzahl der DA Neurone im Gehirn Drosophila mit dem Alter abnimmt 9, 11, jedoch altersabhängige Neurodegeneration bei Fliegen beobachtet wird, wo PD-chromosomale Gene mutiert worden / überexprimiert um menschliche Krankheiten zu modellieren5. Die Expression von humanen α-Synuclein in DA Neuronen hat eine solche Wirkung und damit als Modell für PD verwendet worden. Hier beschreiben wir einen Test für DA Neurone im gesamten Gehirns zählen Aktivierungen mit TH als Zell-Marker. Dieser Test wurde von 13 und 10 angepasst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Assays stellen einen nützlichen Ansatz, um die Rolle von spezifischen Genen zu untersuchen, Signalwege oder kleinen Verbindungen bei der Aufrechterhaltung der DA Neuronen in Alterung sowie bei verschiedenen Krankheiten verbunden genetischen Hintergründen (Übersicht in 5).
Die startle induzierten negativen Geotaxis Verhalten von Drosophila wurde ausgiebig als funktionelle Auslesen für die Funktionalität des DA Neuronen in unterschiedlichen genet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Leo Pallanck für Fliegenfischer Aktien, Christine Sommers für technische Unterstützung und Gerasimos P. Sykiotis für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch das NIH Ausbildungsförderung T32CA009363 zu MCB finanziert
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) |
Materials Table.
References
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