Valutare fenotipi neurodegenerative<em> Drosophila</em> Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

Summary

Qui descriviamo due saggi che sono stati stabiliti per studiare neurodegenerazione età-dipendente di dopaminergici (DA) neuroni in<em> Drosophila</em>: L'arrampicata / saggio geotassi negativo trasalimento indotta che consente di studiare gli effetti funzionali di neuroni DA degenerazione e l'immunoistochimica della tirosina idrossilasi, che viene utilizzato per identificare e contare i neuroni DA in monta tutto il cervello.

Abstract

Drosophila melanogaster è un modello valido organismo per studiare invecchiamento e processi degenerativi patologici nel sistema nervoso. I vantaggi del volo come un sistema sperimentale comprendono la sua trattabilità genetica, vita breve e la possibilità di osservare ed analizzare quantitativamente comportamenti complessi. L'espressione dei geni delle malattie legate a specifiche popolazioni neuronali del cervello Drosophila, può essere usato per modellare le malattie neurodegenerative come il Parkinson e l'Alzheimer ^5.

Dopaminergici (DA) i neuroni sono tra le popolazioni più vulnerabili neuronali nel cervello umano di invecchiamento. Nella malattia di Parkinson (PD), il disturbo più comune movimento neurodegenerativa, la perdita accelerata di DA neuroni porta ad un declino progressivo e irreversibile nella funzione locomotoria. Oltre all'età e l'esposizione a tossine ambientali, perdita di neuroni DA è esacerbata da mutazioni specifiche nella codificao regioni promotrici di diversi geni. L'identificazione di tali alleli PD-associati fornisce la base sperimentale per l'utilizzo di Drosophila come modello per studiare neurodegenerazione dei neuroni DA in vivo. Ad esempio, l'espressione del gene umano α-sinucleina PD-linked in Drosophila neuroni DA ricapitola alcune caratteristiche della malattia umana, come ad esempio la perdita progressiva di neuroni DA e declino della funzione locomotoria ^2. Di conseguenza, questo modello è stato utilizzato con successo per identificare potenziali target terapeutici nel PD ^8.

Qui descriviamo due saggi che sono stati comunemente usati per studiare neurodegenerazione età-dipendente dei neuroni DA in Drosophila: un saggio di scalata in base alla risposta di trasalimento indotta geotassi negativo e tirosina idrossilasi immunoistochimica di tutto il cervello adulto monta per monitorare il numero di neuroni DA in età diverse. In entrambi i casi, l'espressione in vivo di UAS transgenes specificamente in neuroni DA possono essere ottenuti utilizzando una tirosina idrossilasi (TH) promotore-GAL4 driver di linea ^{3, 10.}

Introduction

La specificità dei saggi descritti qui si basa sull'utilizzo di una linea di volo GAL4 che sfrutta le sequenze regolatorie del gene della tirosina idrossilasi raggiungere espressione specifica in neuroni dopaminergici ^3. Tirosina idrossilasi catalizza la prima e fattore limitante nella sintesi della dopamina. Immunoreattività TH Nell'adulto mosca sovrappone cervello con quello della dopamina, rendendo TH un buon candidato per identificare neuroni DA in vivo (vedi per esempio ^6). Inoltre, il modello di espressione di THGal4 è più specifico di quella di altri GAL4 linee come DdcGal4, che contiene sequenze regolatrici dal gene della dopa decarbossilasi e pilota l'espressione transgenica non solo nei neuroni DA, ma anche nei neuroni serotoninergici e sottoinsiemi di cellule gliali ³ .

Feany e Bender (2000) in primo luogo osservato che l'espressione di pan-neuronale del gene PD-linked α-sinucleina umana accelera la perdita progressiva di startle indotta comportamento geotassi negativo in Drosophila. abbiamo osservato risultati simili utilizzando la specifica linea di DA-neurone THGal4 per guidare il expressionof un α-sinucleina transgene ¹⁰ e utilizzato questa funzionalità read-out per studiare il ruolo neuroprotettivo del percorso Nrf2 in questo Drosophila modello di PD ^14. Il dosaggio specifico qui descritto è adattato da ² e ^3.

Il cervello Drosophila contiene più di 100 neuroni DA, disposte in almeno cinque diversi cluster (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) che può essere visualizzato in supporti interi cerebrali mediante microscopia confocale (vedi per esempio ¹¹ e ^7). E 'ancora controverso se il numero di neuroni DA nel Drosophila cervello diminuisce con l'età ^{9, 11,} tuttavia, neurodegenerazione età-dipendente si osserva in linea in cui sono stati mutati geni PD-linked / overexpressed per modellare malattie umane5. L'espressione di α-sinucleina umana in DA neuroni ha un tale effetto e, quindi, è stata usata come modello per PD. Qui si descrive un saggio di neuroni DA contano in tutto il cervello monta utilizzando TH come marker delle cellule. Questo test è stato adattato da ¹³ e ^10.

Protocol

1. Trasalimento indotta Negativo geotassi Assay Selezionare mosche del genotipo desiderato, separarli per sesso, in modo casuale raggrupparli in coorti di 20-30 animali e li lanciano in nuovi flaconi cibo ogni 2-3 giorni; test di ogni set di mosche (cioè coorti di pari età, una coorte / genotipo) almeno una volta alla settimana. Trenta minuti prima della prova geotassi negativo, anestetizzare le mosche con la CO 2 e metterli in tubi di plastica trasparente pre-etichettati fatti…

Representative Results

Abbiamo utilizzato i saggi descritti qui per studiare il ruolo della sollecitazione protettiva Nrf2 percorso in un modello di Drosophila PD 14. Questo modello si basa sull'espressione del gene α-sinucleina umana in neuroni DA utilizzando un TH GAL4 pilotaggio 2, 10. La figura 1 mostra un risultato rappresentativo di un geotassi negativi trasalimento indotte (climbing) del saggio in mosche maschio che esprimono diversi transgeni sotto il co…

Discussion

I saggi qui descritti forniscono un approccio utile per studiare il ruolo di specifici geni, vie di segnalazione o piccoli composti nella manutenzione di neuroni DA nell'invecchiamento e in diversi contesti genetici malattie collegate (recensione in ^5).

Il comportamento trasalimento indotta geotassi negativo di Drosophila è stato ampiamente utilizzato come funzionale read-out per la funzionalità dei neuroni DA in diversi contesti genetici, in particolare in presenza…

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
			Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)

Materials Table.