에 신약 표현형을 평가<em> 초파리</em> 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색
Summary
여기에 우리가있는 도파민 (DA) 신경 세포의 연령에 따라 신경 변성을 연구하기 위해 설립 된 두 가지 분석을 설명<em> 초파리</em> 등산 / DA 뉴런의 변성 및 전체 뇌 마운트의 DA 뉴런을 식별하고 계산하는 데 사용되는 티로신 수산화 효소 면역 염색의 기능 효과를 연구 할 수 있도록 놀라게 의한 부정 geotaxis 분석.
Abstract
초파리는 신경계 노화와 병적 인 퇴행성 과정을 연구하는 중요한 모델 생물이다. 실험 시스템으로 파리의 장점은 유전 온순함, 짧은 수명과 관찰하고 정량적으로 복잡한 행동을 분석 할 수 있습니다. 초파리 뇌의 특정 신경 세포 집단에서 질병에 연결된 유전자의 발현 등 파킨슨 병과 알츠하이머 5 인간 neurodegenerative 질병을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.
도파민 (DA) 신경 세포는 노화 인간의 두뇌에서 가장 취약한 신경 인구 중입니다. 파킨슨 병에 (PD), 가장 일반적인 퇴행성 운동 장애, DA 뉴런의 가속 손실 전위 함수의 진보와 돌이킬 수없는 쇠퇴에 이르게한다. 나이와 환경 독소에 노출뿐만 아니라, DA 뉴런의 손실은 코드의 특정 돌연변이에 의해 악화됩니다여러 유전자 또는 프로모터 영역. 같은 PD-연관된 대립 유전자의 식별은 생체 내에서 DA 뉴런의 신경 퇴행을 연구하는 모델로 초파리의 사용에 대한 실험적 기초를 제공합니다. 예를 들어, 초파리 DA 뉴런 recapitulates 인간의 질병의 일부 기능, DA의 뉴런의 예를 들어 진보적 인 손실 감소 전위 기능이있는 PD 링크 된 인간 α-synuclein의 유전자의 발현. 따라서,이 모델이 성공적으로 PD 8 잠재적 인 치료 목표를 식별하는 데 사용되었습니다.
전체 성인 뇌의 놀람에 의한 부정 geotaxis 응답 및 티로신 수산화 면역 염색에 따라 등반 분석이 DA 뉴런의 수를 모니터링하는 마운트 : 여기에 우리가 일반적으로 초파리의 DA 뉴런의 나이에 따라 신경 변성을 연구하는 데 사용 된 두 가지 분석을 설명 다른 나이에. 두 경우 모두, UAS t의 생체 내 발현DA의 뉴런에 특별히 ransgenes은 티로신 수산화 효소 (TH) 프로모터 GAL4 드라이버 3 호선, 10을 사용하여 얻을 수 있습니다.
Introduction
여기에 설명 된 분석의 특이성은 도파민 뉴런 3의 특정 표현을 달성하기 위해 티로신 수산화 효소 유전자의 조절 서열을 이용 GAL4 플라이 라인의 사용에 의존하고 있습니다. 티로신 수산화 효소는 도파민 합성의 첫 번째 및 속도 제한 단계를 촉매. 생체 내에서 DA의 뉴런 (예 6을 참조)을 식별 할 수있는 좋은 후보 TH하는 도파민의과 성인 플라이 뇌 중복의 TH 면역 반응. 또한, THGal4의 발현 패턴 도파 탈 카르복시 화 효소 유전자의 조절 서열을 포함하고 DA 뉴런에서뿐만 아니라 유전자 발현을 드라이브 같은 DdcGal4 다른 GAL4 라인보다 더 구체적이고, 또한 3 glial 세포의 serotoninergic 뉴런 집합에 .
Feany 및 벤더 (2000)은 최초의 PD 링크 된 인간 α-synuclein의 유전자의 팬의 연결을 표현 역의 진보적 인 손실을 가속 관찰초파리 rtle에 의한 부정 geotaxis 동작. 우리는 expressionof α-synuclein의 유전자 10를 구동하는 DA-신경 세포의 특정 THGal4 줄을 사용하여 유사한 결과를 관찰하고이에 NRF2 통로의 신경 역할을 연구하기 위해이 기능을 읽기 중 사용한 PD 14 초파리 모델. 여기에 설명 된 특정 분석은 2와 3에서 적응됩니다.
초파리 뇌 (예 : 11 7 참조) 공 촛점 현미경에 의해 뇌 전체 마운트에 시각화 할 수있는 적어도 5 개의 다른 클러스터에 배치 100 개 이상의 DA 뉴런 (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3)가 포함되어 있습니다. 그러나 연령에 따라 신경 변성이 PD 연결된 유전자가 변이 된 곳에 파리에서 관찰 / 인간의 질병을 모델로 과발현이며 나이 9, 11과 초파리 뇌의 감소에있는 DA의 뉴런의 수 있는지 여부를 아직 논란이있다5. DA 신경 세포에서 인간의 α-synuclein의 발현은 영향을 가지고 있으며, 따라서, PD를위한 모델로 사용하고있다. 여기에서 우리는 DA의 뉴런은 세포 마커로 TH를 사용하여 마운트 전체 뇌의 계산에 대한 분석을 설명합니다. 이 분석은 13, 10에서 적응하고있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
분석은 서로 다른 질병에 연결된 유전 배경 (5 위)뿐 아니라 노화 DA 신경 세포의 유지에 경로 또는 작은 화합물 신호, 특정 유전자의 역할을 연구하는 유용한 방법을 제공합니다 여기에 설명.
초파리의 놀람에 의한 부정 geotaxis 동작은 광범위하게, 특히 PD 연결된 돌연변이의 존재에있는 다른 유전 적 배경에서 DA 뉴런의 기능에 대한 읽기 아웃 기능으로 사용되?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 토론에 대한 기술 지원 및 Gerasimos P. Sykiotis를 들어, 플라이 주식에 대한 크리스틴 머스을 레오 Pallanck 감사합니다. 이 작품은 MCB에 NIH 연수 부여 T32CA009363에 의해 투자되었다
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) |
Materials Table.
References
- Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson’s disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
- Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson’s Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
- Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
- Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson’s disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson’s disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).
