Her beskriver vi to analysene som er etablert for å studere aldersavhengig neurodegeneration av dopaminerge (DA) nevroner i<em> Drosophila</em>: Klatring / skremmeeffekt-indusert negativ geotaxis analysen som gjør det mulig å studere funksjonelle effekter av DA nevroner degenerasjon og tyrosin hydroksylase farging som brukes til å identifisere og telle DA nevroner i hele hjernen mounts.
Drosophila melanogaster er en verdifull modell organisme for å studere aldring og patologiske degenerative prosesser i nervesystemet. Fordelene med fly som et eksperimentelt system inkluderer dens genetiske tractability, kort levetid og muligheten til å observere og kvantitativt analysere komplekse atferd. Ekspresjon av sykdom-bundne gener i spesifikke nevronale populasjoner av Drosophila hjernen, kan brukes for å modellere humane nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons og Alzheimers 5.
Dopaminerge (DA) nevroner er blant de mest sårbare nevronale populasjoner i den aldrende menneskelige hjerne. I Parkinsons sykdom (PD), den vanligste nevrodegenerativ lidelse bevegelse, fører akselerert tap av DA neuroner til en progressiv og irreversibel nedgang i bevegelsesaktiviteten funksjon. I tillegg til alder og eksponering for miljøgifter, er tapet av neuroner DA forverret av spesifikke mutasjoner i den kodendeeller promoter regioner av flere gener. Identifiseringen av slike PD-assosierte alleler gir den eksperimentelt grunnlag for bruk av Drosophila som en modell for å studere neurodegenerering av DA-neuroner in vivo. For eksempel uttrykk for PD-linked menneskelig α-synuclein genet i Drosophila DA nevroner sammenfatter noen av funksjonene i den menneskelige sykdom, f.eks progressive tap av DA nevroner og fallende locomotor 세스 funksjon. Følgelig har denne modellen blitt brukt til å identifisere potensielle terapeutiske mål i PD 8.
Her beskriver vi to analysene som har ofte blitt brukt til å studere aldersavhengig neurodegeneration av DA nevroner i Drosophila: en klatring analysen basert på skremmeeffekt-indusert negativ geotaxis respons og tyrosin hydroksylase farging av hele den voksne hjernen monterer å overvåke antallet DA nevroner på ulike alderstrinn. I begge tilfeller er in vivo-ekspresjon av UAS transgenes spesifikt i DA-nevroner kan oppnås ved hjelp av et tyrosin-hydroksylase (TH) promoter-Gal4 driver linje 3, 10.
Spesifisiteten til assayene som beskrives her, er avhengig av bruk av et Gal4 fluesnøre som utnytter de regulatoriske sekvenser av tyrosin-hydroksylase-genet for å oppnå spesifikk ekspresjon i dopaminerge nevroner 3. Tyrosin hydroksylase katalyserer det første og hastighetsbegrensende trinn i dopamin-syntese. TH immunoreaktivitet i voksen hjerne fly overlapper området av dopamin, slik TH en god kandidat for å identifisere DA-neuroner in vivo (se for eksempel 6). Videre er uttrykket mønster av THGal4 mer spesifikk enn for andre Gal4 linjer som DdcGal4, som inneholder regulatoriske sekvenser fra den dopa-dekarboksylase-genet og driver transgen ekspresjon ikke bare i DA-neuroner, men også i serotonerge neuroner og gliaceller delsett av tre .
Feany og Bender (2000) først observert at pan-neuronal uttrykk for PD-linked menneskelig α-synuclein genet akselererer den progressive tap av startle-indusert negativ geotaxis atferd i Drosophila. Vi har observert lignende resultater ved bruk av DA-nervecellen spesifikk THGal4 linje for å drive expressionof en α-synuclein transgene 10 og brukt dette funksjonelle lese-ut for å studere nervecellene rolle Nrf2 veien i denne Drosophila modell av PD 14. Den spesifikke analysen beskrevet her er tilpasset fra 2 og 3.
Drosophila-hjerne inneholder mer enn 100 DA-nevroner, anordnet i minst fem forskjellige klynger (PPL1, PPL2, PAL, spm1 / 2, PPM3) som kan visualiseres i hele hjernen monteringer ved konfokal mikroskopi (se for eksempel 11 og 7). Det er fortsatt kontroversielt hvorvidt eller ikke antallet av DA-nevroner i Drosophila-hjerne avtar med alderen 9, 11, men er aldersavhengig neurodegenerering observert i fluer hvor PD-bundne gener har blitt mutert / overuttrykt å modellere human diseases5. Ekspresjonen av humant α-synuclein in DA neuroner har en slik virkning, og derfor, har blitt benyttet som en modell for Parkinsons sykdom. Her beskriver vi en analyse for DA nevroner telle i hele hjernen mounts hjelp TH som en celle markør. Denne analysen har blitt tilpasset fra 13 og 10.
Analysene er beskrevet her gi en nyttig tilnærming for å studere rollen til spesifikke gener, signalveier eller små forbindelser i vedlikehold av DA nevroner i aldring samt i ulike sykdomsfremkallende knyttet genetiske bakgrunn (anmeldt i 5).
Skremmeeffekt-indusert negativ geotaxis atferd Drosophila har vært mye brukt som en funksjonell lese-out for funksjonaliteten DA nevroner i ulike genetiske bakgrunn, særlig i nærvær av PD-linked mutasjoner. Noen avvik mellom u…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Leo Pallanck for fly aksjer, Christine Sommers for teknisk assistanse og Gerasimos P. Sykiotis for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av NIH trening stipend T32CA009363 til MCB
Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
DABCO | Sigma | D2522 | |
Equipment | |||
Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) |
Materials Table.