Vurdere nevrodegenerative Fenotyper i<em> Drosophila</em> Dopaminerge nevroner ved å klatre Analyser og Whole Brain farging

Summary

Her beskriver vi to analysene som er etablert for å studere aldersavhengig neurodegeneration av dopaminerge (DA) nevroner i<em> Drosophila</em>: Klatring / skremmeeffekt-indusert negativ geotaxis analysen som gjør det mulig å studere funksjonelle effekter av DA nevroner degenerasjon og tyrosin hydroksylase farging som brukes til å identifisere og telle DA nevroner i hele hjernen mounts.

Abstract

Drosophila melanogaster er en verdifull modell organisme for å studere aldring og patologiske degenerative prosesser i nervesystemet. Fordelene med fly som et eksperimentelt system inkluderer dens genetiske tractability, kort levetid og muligheten til å observere og kvantitativt analysere komplekse atferd. Ekspresjon av sykdom-bundne gener i spesifikke nevronale populasjoner av Drosophila hjernen, kan brukes for å modellere humane nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons og Alzheimers ^5.

Dopaminerge (DA) nevroner er blant de mest sårbare nevronale populasjoner i den aldrende menneskelige hjerne. I Parkinsons sykdom (PD), den vanligste nevrodegenerativ lidelse bevegelse, fører akselerert tap av DA neuroner til en progressiv og irreversibel nedgang i bevegelsesaktiviteten funksjon. I tillegg til alder og eksponering for miljøgifter, er tapet av neuroner DA forverret av spesifikke mutasjoner i den kodendeeller promoter regioner av flere gener. Identifiseringen av slike PD-assosierte alleler gir den eksperimentelt grunnlag for bruk av Drosophila som en modell for å studere neurodegenerering av DA-neuroner in vivo. For eksempel uttrykk for PD-linked menneskelig α-synuclein genet i Drosophila DA nevroner sammenfatter noen av funksjonene i den menneskelige sykdom, f.eks progressive tap av DA nevroner og fallende locomotor ^세스 funksjon. Følgelig har denne modellen blitt brukt til å identifisere potensielle terapeutiske mål i PD ^8.

Her beskriver vi to analysene som har ofte blitt brukt til å studere aldersavhengig neurodegeneration av DA nevroner i Drosophila: en klatring analysen basert på skremmeeffekt-indusert negativ geotaxis respons og tyrosin hydroksylase farging av hele den voksne hjernen monterer å overvåke antallet DA nevroner på ulike alderstrinn. I begge tilfeller er in vivo-ekspresjon av UAS transgenes spesifikt i DA-nevroner kan oppnås ved hjelp av et tyrosin-hydroksylase (TH) promoter-Gal4 driver linje ^{3, 10.}

Introduction

Spesifisiteten til assayene som beskrives her, er avhengig av bruk av et Gal4 fluesnøre som utnytter de regulatoriske sekvenser av tyrosin-hydroksylase-genet for å oppnå spesifikk ekspresjon i dopaminerge nevroner ^3. Tyrosin hydroksylase katalyserer det første og hastighetsbegrensende trinn i dopamin-syntese. TH immunoreaktivitet i voksen hjerne fly overlapper området av dopamin, slik TH en god kandidat for å identifisere DA-neuroner in vivo (se for eksempel ^6). Videre er uttrykket mønster av THGal4 mer spesifikk enn for andre Gal4 linjer som DdcGal4, som inneholder regulatoriske sekvenser fra den dopa-dekarboksylase-genet og driver transgen ekspresjon ikke bare i DA-neuroner, men også i serotonerge neuroner og gliaceller delsett av ^tre .

Feany og Bender (2000) først observert at pan-neuronal uttrykk for PD-linked menneskelig α-synuclein genet akselererer den progressive tap av startle-indusert negativ geotaxis atferd i Drosophila. Vi har observert lignende resultater ved bruk av DA-nervecellen spesifikk THGal4 linje for å drive expressionof en α-synuclein transgene ¹⁰ og brukt dette funksjonelle lese-ut for å studere nervecellene rolle Nrf2 veien i denne Drosophila modell av PD ^14. Den spesifikke analysen beskrevet her er tilpasset fra ² og ^3.

Drosophila-hjerne inneholder mer enn 100 DA-nevroner, anordnet i minst fem forskjellige klynger (PPL1, PPL2, PAL, spm1 / 2, PPM3) som kan visualiseres i hele hjernen monteringer ved konfokal mikroskopi (se for eksempel ¹¹ og ^7). Det er fortsatt kontroversielt hvorvidt eller ikke antallet av DA-nevroner i Drosophila-hjerne avtar med alderen ^{9, 11,} men er aldersavhengig neurodegenerering observert i fluer hvor PD-bundne gener har blitt mutert / overuttrykt å modellere human diseases5. Ekspresjonen av humant α-synuclein in DA neuroner har en slik virkning, og derfor, har blitt benyttet som en modell for Parkinsons sykdom. Her beskriver vi en analyse for DA nevroner telle i hele hjernen mounts hjelp TH som en celle markør. Denne analysen har blitt tilpasset fra ¹³ og ^10.

Protocol

En. Skremmeeffekt-indusert Negative Geotaxis analysen Velg fluer ønsket genotype, skille dem etter kjønn, tilfeldig gruppere dem i årskull av 20-30 dyr, og snu dem inn i nye mat ampuller hver 2-3 dager, test hvert sett av fluer (dvs. age-matchet kohorter, en kohort / genotype) minst en gang i uken. Tretti minutter før den negative geotaxis test, anesthetize fluene med CO 2 og plassere dem i pre-merket klar plast rør laget med to tomme mat hetteglass (se Materialer Ta…

Representative Results

Vi har brukt de analysene som er beskrevet her for å studere rollen av stress beskyttende Nrf2 veien i en Drosophila modell av PD 14. Denne modellen bygger på uttrykk for den menneskelige α-synuclein genet i DA nevroner ved hjelp av en TH Gal4 driver 2, 10. Figur 1 viser et representativt resultat av en skremmeeffekt-indusert negative geotaxis (klatring) analysen i mannlige fluer uttrykker ulike transgener under kontroll av TH Gal4 driver. A…

Discussion

Analysene er beskrevet her gi en nyttig tilnærming for å studere rollen til spesifikke gener, signalveier eller små forbindelser i vedlikehold av DA nevroner i aldring samt i ulike sykdomsfremkallende knyttet genetiske bakgrunn (anmeldt i ^5).

Skremmeeffekt-indusert negativ geotaxis atferd Drosophila har vært mye brukt som en funksjonell lese-out for funksjonaliteten DA nevroner i ulike genetiske bakgrunn, særlig i nærvær av PD-linked mutasjoner. Noen avvik mellom u…

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
			Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)

Materials Table.