Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em<em> Drosophila</em> Neurônios dopaminérgicos subindo Ensaios e toda Imunocoloração Cérebro

Summary

Aqui nós descrevemos dois ensaios que foram estabelecidos para estudar neurodegeneração idade-dependente de dopaminérgicos (DA) neurônios<em> Drosophila</em>: A escalada / ensaio geotaxis negativa induzida sobressalto que permite estudar os efeitos funcionais de neurónios DA degeneração e a imunomarcação de tirosina-hidroxilase, que é usado para identificar e contar os neurónios do cérebro de DA em montagens inteiras.

Abstract

Drosophila melanogaster é um organismo modelo valioso para estudar processos degenerativos do envelhecimento e patológicas do sistema nervoso. As vantagens da mosca como um sistema experimental incluir sua rastreabilidade genética, vida curta ea possibilidade de observar e analisar quantitativamente os comportamentos complexos. A expressão de genes ligados à doença em populações neuronais específicas do cérebro de Drosophila, pode ser usado para modelar doenças neurodegenerativas humanas, tais como a doença de Parkinson e de Alzheimer ^5.

Dopaminérgicos (DA) neurônios estão entre as populações mais vulneráveis ​​neuronais no cérebro humano envelhecimento. Na doença de Parkinson (DP), a desordem de movimento neurodegenerativa mais comum, a perda acelerada de DA neurónios conduz a uma deterioração progressiva e irreversível da função locomotora. Além da idade e exposição a toxinas ambientais, a perda de neurónios DA é exacerbado por mutações pontuais no codificanteou regiões promotoras dos vários genes. A identificação de tais alelos DP associados fornece a base experimental para a utilização de Drosophila como um modelo para estudar a neurodegeneração de neurónios DA in vivo. Por exemplo, a expressão do gene α-sinucleína humana PD-ligados em Drosophila neurônios DA recapitula algumas características da doença humana, por exemplo, perda progressiva de neurônios DA e declínio da função locomotora ^2. Assim, este modelo tem sido utilizado com sucesso para identificar potenciais alvos terapêuticos na DP ^8.

Aqui nós descrevemos dois ensaios que têm sido comumente usados ​​para estudar a neurodegeneração idade-dependente de Da neurônios em Drosophila: um ensaio de escalada com base na resposta de sobressalto geotaxis negativa induzida e tirosina hidroxilase immunostaining de cérebro adulto todo monta para monitorar o número de neurônios DA em diferentes idades. Em ambos os casos, a expressão in vivo de t UASransgenes especificamente em neurónios DA pode ser conseguido através de uma tirosina-hidroxilase (TH)-Gal4 promotor de linha de condutor ^{3, 10.}

Introduction

A especificidade dos ensaios descritos aqui baseia-se no uso de uma linha de mosca Gal4 que explora as sequências reguladoras do gene da hidroxilase de tirosina, para conseguir a expressão específica de neurónios dopaminérgicos ^3. Tirosina hidroxilase catalisa a primeira e passo limitante da velocidade na síntese de dopamina. Imunorreactividade TH na mosca sobrepõe cérebro adulto com a da dopamina, tornando TH um bom candidato para identificar neurónios DA in vivo (ver, por exemplo ^6). Além disso, o padrão de expressão THGal4 é mais específico do que a de outras linhas, tais como Gal4 DdcGal4, que contém as sequências reguladoras a partir do gene da dopa descarboxilase e dirige a expressão transgénica não apenas em neurónios DA, mas também nos neurónios serotoninérgicos e subconjuntos de células gliais ³ .

Feany e Bender (2000) observaram pela primeira vez que a expressão de pan-neuronal do gene α-sinucleína humana DP-linked acelera a perda progressiva de stageotaxis comportamento negativo rtle induzida em Drosophila. Temos observado resultados similares usando a linha DA-neurônio específico THGal4 para conduzir o expressionof uma α-sinucleína transgene ¹⁰ e usou este funcional de leitura para estudar o papel neuroprotetor da via Nrf2 neste Drosophila modelo de PD ^14. O ensaio específico aqui descrito é adaptado a partir de ² e ^3.

O cérebro de Drosophila contém mais de 100 neurónios DA, dispostos em, pelo menos, cinco grupos diferentes (PPL1, PPL2, PAL PPM1 / 2, ppm3) que podem ser visualizados nos seus suportes de a totalidade do cérebro por meio de microscopia confocal (ver, por ^{exemplo, 11} e ^7). É ainda controverso se o número de neurónios DA em declínios cerebrais Drosophila com ⁹ anos ^{de idade, 11,} no entanto, dependente da idade, a neurodegeneração é observada nas moscas onde os genes PD-linked foram mutados / overexpressed para modelar doenças humanas5. A expressão de humano α-sinucleína em DA neurónios tem tal efeito e, consequentemente, tem sido utilizada como um modelo para a DP. Aqui nós descrevemos um ensaio para neurônios DA contar no cérebro todo montado usando TH como um marcador de células. Este ensaio foi adaptado a partir de ¹³ e ^10.

Protocol

1. Sobressalto induzida Ensaio geotaxis Negativo Selecione moscas do genótipo desejado, separá-los por gênero, aleatoriamente agrupá-los em grupos de 20-30 animais e lançá-los em novos frascos de comida a cada 2-3 dias, teste cada conjunto de moscas (ou seja, grupos pareados por idade, uma coorte / genótipo) pelo menos uma vez por semana. Trinta minutos antes do teste geotaxis negativo, anestesiar as moscas com CO 2 e colocá-los em tubos de plástico transparente pré-rot…

Representative Results

Usamos os ensaios descritos aqui para estudar o papel do protector via Nrf2 o stress num modelo de Drosophila de DP 14. Este modelo baseia-se na expressão do gene α-sinucleína humana em neurónios DA utilizando um condutor de Gal4 TH 2, 10. A Figura 1 mostra um resultado representativo de um sobressalto induzidas geotaxis negativos (subida) de ensaio nas moscas macho que expressam transgenes diferentes sob o controlo do controlador de TH Gal…

Discussion

Os ensaios descritos aqui proporcionam uma abordagem útil para estudar o papel de genes específicos, as vias de sinalização ou de compostos pequenos na manutenção de neurónios DA em envelhecimento, bem como em diferentes fundos genéticos doenças ligadas (revisto em ^5).

O comportamento negativo geotaxis sobressalto induzida de Drosophila tem sido amplamente utilizada como um funcional leia-out para a funcionalidade do AD neurônios em diferentes origens genéticas…

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
			Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)

Materials Table.