Оценка Нейродегенеративных фенотипов<em> Drosophila</em> Дофаминергических нейронов, забравшись на анализы и полного Иммуноокрашивание мозга

Summary

Здесь мы рассмотрим два анализы, которые были созданы для изучения возрастных нейродегенеративных дофаминергических (ДА) нейронов в<em> Drosophila</em>: Восхождение / испуга индуцированных отрицательном анализе геотаксис которая позволяет изучать функциональные эффекты да нейронов дегенерации и тирозин гидроксилазы иммуноокрашивания который используется для выявления и графа Д. А. нейронов в тотальных мозга.

Abstract

Дрозофилы является ценным организма моделью для изучения старения и патологических дегенеративных процессов в нервной системе. Преимущества летать в качестве экспериментальной системе, включают свой генетический трактабильность, короткий срок службы, а также возможность наблюдать и количественно анализируют сложные поведения. Выражение заболеваний связанных генов в специфических популяций нейронов головного мозга Drosophila, могут быть использованы для моделирования человеческих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера ^5.

Дофаминергические (DA) нейроны являются одними из самых уязвимых популяций нейронов в процессе старения человеческого мозга. При болезни Паркинсона (БП), наиболее распространенными нейродегенеративных расстройств движения, ускоренной потери DA нейронов приводит к прогрессирующему и необратимому снижению двигательной функции. Помимо возраста и воздействия токсинов окружающей среды, потеря да нейронов усугубляется специфических мутаций в кодирующихили промоторных областей ряда генов. Выявление таких PD-связанных аллелей обеспечивает экспериментальную базу для использования Drosophila в качестве модели для изучения нейродегенерацию DA нейронов в живом организме. Например, экспрессия PD-связанный человеческий α-синуклеина гена у дрозофилы DA повторяет нейронов некоторые особенности болезней человека, например прогрессирующую потерю нейронов DA и снижение двигательной функции ^2. Соответственно, эта модель была успешно использована для выявления потенциальных терапевтических мишеней при БП ^8.

Здесь мы рассмотрим два анализов, которые обычно используются для изучения возрастных нейродегенеративных DA нейронов у дрозофилы: восхождение анализ, основанный на испуг индуцированных отрицательный ответ геотаксис и тирозин гидроксилазы иммуноокрашивания целого мозга взрослого монтирует контролировать количество да нейронов в разном возрасте. В обоих случаях в естественных условиях выражение UAS тransgenes в частности, в нейронах DA может быть достигнуто с помощью тирозин-гидроксилазы (TH) промотор-Gal4 драйверов линии ^{3, 10.}

Introduction

Специфичность анализов, описанных здесь опирается на использование Gal4 шнура, который использует регуляторные последовательности гена тирозин-гидроксилазы для достижения конкретных выражение в дофаминергических нейронов ^3. Тирозингидроксилаза катализирует первую и ограничивающей скорость стадией в синтезе дофамина. TH иммунореактивности в мозге взрослой мухи накладывается на допамин, что делает TH хорошим кандидатом для выявления да нейронов в естественных условиях (см., например, ^6). Более того, характер экспрессии THGal4 является более конкретным, чем у других Gal4 линии, такие как DdcGal4, которая содержит регуляторные последовательности из гена допа-декарбоксилазы и приводит трансгенной экспрессии не только в нейронах DA, но и в серотонинергических нейронов и подмножества глиальные клетки ^три .

Feany и Бендер (2000) первым заметил, что пан-нейронов выражение PD-α человека связан-синуклеина ускоряет прогрессирующей потерей станцииrtle индуцированных негативное поведение геотаксис у дрозофилы. Мы наблюдали подобные результаты помощью DA-нейронов конкретных THGal4 линии ездить expressionof α-синуклеина трансгенов ¹⁰ и использовать этот функционал для чтения с целью изучения роли нейропротекторные Nrf2 пути в этом Drosophila модели БП ^14. Конкретные анализа, описанного здесь адаптирован из ² и ^3.

Мозг дрозофилы содержит более 100 DA нейронов, расположены по меньшей мере 5 различных кластеров (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3), которые могут быть визуализированы в тотальных мозга с помощью конфокальной микроскопии (см., например, ¹¹ и ^7). До сих пор спорным, является ли количество нейронов DA в мозге Drosophila снижается с возрастом ^{9, 11,} однако возрастной нейродегенерации наблюдается у мух где PD-сцепленных генов мутировали / сверхэкспрессия для моделирования болезней человека5. Выражение человеческого α-синуклеина в DA нейронов имеет такой эффект, а значит, был использован в качестве модели для PD. Здесь мы опишем тест для DA нейронов рассчитывать на весь мозг монтирует использованием TH как клеточный маркер. Этот анализ был адаптирован от ¹³ до ^10.

Protocol

1. Startle индуцированных отрицательном анализе геотаксис Выберите мух нужного генотипа, разделите их по полу, случайно сгруппировать их в когортах 20-30 животных и отражение их в новые флаконы еды каждые 2-3 дня; тестов каждый набор мух (т.е. соответствующего возраста когорты, одна ?…

Representative Results

Мы использовали анализы, описанные здесь, чтобы изучить роль стресса защитные путь Nrf2 в модели дрозофилы PD 14. Эта модель основана на экспрессию человеческого α-синуклеина в нейронах DA использованием TH Gal4 водитель 2, 10. На рисунке 1 показана предс?…

Discussion

Анализы, описанные здесь обеспечить полезный подход к изучению роли определенных генов, сигнальных путей или небольших соединений в поддержании DA нейронов в процессе старения, а также в различных болезней, связанных генетическим фоном (см. обзор в ^5).

Испуга-индуци…

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
			Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)

Materials Table.