La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em> Drosophila</em> Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Summary

A continuación se describen dos ensayos que se han establecido para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas dopaminérgicas (DA) en<em> Drosophila</em>: La escalada / ensayo geotaxis negativo sobresalto inducida que permite estudiar los efectos funcionales de las neuronas DA degeneración y la inmunomarcación tirosina hidroxilasa, que se utiliza para identificar y contar las neuronas DA en montajes de todo el cerebro.

Abstract

Drosophila melanogaster es una valiosa organismo modelo para estudiar el envejecimiento y los procesos patológicos degenerativos en el sistema nervioso. Las ventajas de la marcha como un sistema experimental incluyen su maleabilidad genética, vida corta y la posibilidad de observar y analizar cuantitativamente comportamientos complejos. La expresión de los genes vinculados a la enfermedad en poblaciones neuronales específicas del cerebro de Drosophila, se puede utilizar para modelar enfermedades neurodegenerativas humanas como el Parkinson y el Alzheimer ^5.

Las neuronas dopaminérgicas (DA) se encuentran entre las poblaciones neuronales más vulnerables en el envejecimiento del cerebro humano. En la enfermedad de Parkinson (PD), el trastorno del movimiento más común neurodegenerativa, la pérdida acelerada de neuronas DA conduce a una disminución progresiva e irreversible de la función locomotora. Además de la edad y la exposición a las toxinas ambientales, la pérdida de las neuronas DA se ve agravada por las mutaciones específicas en la codificacióno regiones promotoras de varios genes. La identificación de tales alelos asociada a la EP proporciona la base experimental para el uso de Drosophila como modelo para estudiar la neurodegeneración de las neuronas DA in vivo. Por ejemplo, la expresión del gen humano α-sinucleína PD-vinculados en Drosophila neuronas DA recapitula algunas características de la enfermedad humana, por ejemplo la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas y la disminución de la función locomotora ^2. En consecuencia, este modelo ha sido utilizado con éxito para identificar posibles dianas terapéuticas en la EP ^8.

A continuación se describen dos ensayos que habitualmente se han utilizado para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas DA en Drosophila: un ensayo de escalada en base a la respuesta de sobresalto inducida geotaxis inmunotinción negativa y la tirosina hidroxilasa de todo el cerebro adulto monta para controlar el número de neuronas DA en las diferentes edades. En ambos casos, la expresión in vivo de t UASransgenes específicamente en las neuronas DA se puede lograr mediante el uso de una tirosina hidroxilasa (TH) de la línea controlador promotor ^{Gal4-3, 10.}

Introduction

La especificidad de los ensayos descritos aquí se basa en el uso de una línea de la mosca Gal4 que explota las secuencias reguladoras del gen de la tirosina hidroxilasa para lograr la expresión específica en las neuronas dopaminérgicas ^3. La tirosina hidroxilasa cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la síntesis de dopamina. TH inmunoreactividad en los adultos se superpone cerebro de la mosca con la de la dopamina, lo que hace TH un buen candidato para identificar las neuronas DA in vivo (véase, por ejemplo ^6). Por otra parte, el patrón de expresión de THGal4 es más específico que el de otras líneas de Gal4 como DdcGal4, que contiene secuencias reguladoras del gen de la dopa decarboxilasa y conduce la expresión transgénica no sólo en las neuronas DA, sino también en las neuronas serotoninérgicas y subconjuntos de células gliales ³ .

Feany y Bender (2000) observaron por primera vez que la expresión de pan-neuronal del gen de la α-sinucleína humana DP-ligado acelera la pérdida progresiva de la estacióncomportamiento rtle inducida geotaxis negativa en Drosophila. Hemos observado resultados similares usando la línea específica de neuronas DA THGal4 para conducir la expresiónde la α-sinucleína transgén ¹⁰ y utilizado esta funcionalidad de lectura para estudiar el papel neuroprotector de la vía Nrf2 en este Drosophila modelo de la EP ^14. El ensayo específico que se describe aquí es una adaptación de ² y ^3.

El cerebro de Drosophila contiene más de 100 neuronas DA, dispuestos en al menos 5 grupos diferentes (pPL1, pPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) que se pueden visualizar en montajes de todo el cerebro por microscopía confocal (véase, por ejemplo ¹¹ y ^7). Es todavía es controvertido si o no el número de neuronas DA en el cerebro disminuye Drosophila con ⁹ años de ^{edad, 11,} sin embargo, la neurodegeneración dependiente de la edad se observó en las moscas que se han mutado genes PD-enlazadas / sobreexpresa para modelar enfermedades humanas5. La expresión de humano α-sinucleína en las neuronas DA tiene tal efecto y, por lo tanto, se ha utilizado como un modelo para la EP. A continuación se describe un ensayo para las neuronas DA cuentan en todo el cerebro se monta utilizando TH como marcador celular. Este ensayo ha sido adaptado de ¹³ y ^10.

Protocol

1. Sobresalto inducida Ensayo geotaxis Negativo Seleccione moscas del genotipo deseado, separarlos por sexo, grupo al azar en las cohortes de 20 a 30 animales y voltear en nuevos frascos de alimentos cada 2-3 días, las pruebas de cada conjunto de moscas (es decir, las cohortes de edades similares, una cohorte / genotipo) al menos una vez a la semana. Treinta minutos antes de la prueba geotaxis negativa, anestesiar a las moscas con CO 2 y colocarlos en pre-etiquetados tubos de pl…

Representative Results

Hemos utilizado los ensayos descritos aquí para estudiar el papel de la vía Nrf2 protectora estrés en un modelo de Drosophila de la EP 14. Este modelo se basa en la expresión del gen de la α-sinucleína humana en las neuronas DA utilizando un TH Gal4 conductor 2, 10. La Figura 1 muestra un resultado representativo de un geotaxis negativos inducidos por sobresalto (escalada) de ensayo en las moscas macho que expresan diferentes transgenes b…

Discussion

Los ensayos descritos aquí proporcionar un enfoque útil para estudiar la función de genes específicos, las vías de señalización o compuestos pequeños en el mantenimiento de las neuronas DA en el envejecimiento, así como en diferentes bases genéticas de enfermedades vinculadas (revisado en ^5).

El comportamiento negativo de sobresalto geotaxis inducida de Drosophila se ha usado ampliamente como un funcional de lectura para la funcionalidad de las neuronas DA en di…

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
			Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)

Materials Table.