Uppskatta Neurodegenerativa Fenotyper i<em> Drosophila</em> Dopaminerga neuroner genom att klättra Analyser och Helhjärnstänkande immunostaining

Summary

Här beskriver vi två analyser som har inrättats för att studera åldersberoende neurodegeneration av dopaminerga (DA) neuroner i<em> Drosophila</em>: Klättring / spritta-inducerade negativa geotaxis analys som gör det möjligt att studera de funktionella effekterna av DA neuron degeneration och tyrosinhydroxylas immunofärgningen som används för att identifiera och räkna DA nervceller i hela hjärnan fästen.

Abstract

Drosophila melanogaster är en värdefull modell organism för att studera åldrande och sjukliga degenerativa processer i nervsystemet. Fördelarna med fluga som ett experimentellt system inkluderar dess genetiska spårbarhet, kort livslängd och möjligheten att observera och kvantitativt analysera komplexa beteenden. Uttrycket av sjukdom-länkade gener i specifika neuronala populationer av Drosophila hjärnan, kan användas för att modellera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons och Alzheimers ^5.

Dopaminerga (DA) nervceller är bland de mest sårbara neuronala populationer i den åldrande människans hjärna. Vid Parkinsons sjukdom (PD), den vanligaste neurodegenerativa rörelsestörningar, leder den accelererade förlusten av DA neuron till en progressiv och irreversibel nedgång i rörelseapparaten funktion. Förutom ålder och exponering för miljögifter, är förlust av DA neuron förvärras av specifika mutationer i den kodandeeller promotorn regioner i de olika gener. Identifieringen av sådana PD-associerade alleler ger den experimentella grunden för användningen av Drosophila som en modell för att studera neurodegeneration i DA nervceller in vivo. Till exempel uttrycket av PD-länkade humant α-synuklein gen i Drosophila DA nervceller rekapitulerar vissa funktioner i den mänskliga sjukdomen, t.ex. progressiv förlust av DA neuron och minskande motorisk funktion ^2. Följaktligen har denna modell använts framgångsrikt för att identifiera potentiella terapeutiska mål i PD ^8.

Här beskriver vi två analyser som ofta har använts för att studera åldersberoende neurodegeneration av DA nervceller i Drosophila: a klättring analys baserad på spritta-inducerade negativa geotaxis respons och tyrosinhydroxylas immunfärgning av hela den vuxna hjärnan fästen för att övervaka antalet DA nervceller vid olika åldrar. I båda fallen, in vivo-expression av UAS transgenes bestämt i DA-neuroner kan uppnås genom användning av en tyrosinhydroxylas (TH)-promotor-Gal4 föraruppställning ^{3, 10.}

Introduction

Specificiteten av analyserna beskrivs här förlitar sig på användningen av en Gal4 fluglina som utnyttjar de regulatoriska sekvenserna av tyrosinhydroxylas genen för att uppnå specifika uttryck i dopaminerga neuroner ^3. Tyrosin hydroxylas katalyserar det första och hastighetsbegränsande steget i dopaminsyntes. TH immunoreaktivitet i de vuxna överlappar flyga hjärnan med den hos dopamin, vilket gör TH en bra kandidat för att identifiera DA-neuroner in vivo (se till exempel ^6). Dessutom är uttrycksmönstret av THGal4 mer specifik än den hos andra Gal4 linjer såsom DdcGal4, som innehåller regulatoriska sekvenser från dopadekarboxylas genen och driver transgent uttryck inte bara i DA-neuroner, men också i serotoninerga neuroner och delmängder av gliaceller ³ .

Feany och Bender (2000) konstaterade först att pan-neuronala uttryck av PD-länkade humant α-synuklein gen accelererar gradvis förlust av startle-inducerad negativ geotaxis beteende i Drosophila. Vi har observerat liknande resultat med användning av DA-neuron specifik THGal4 linje att driva expressionof en α-synuclein-transgenen ¹⁰ och används denna funktionella utläsning för att studera den neuroskyddande roll Nrf2 banan i detta Drosophila modell av PD ^14. Den specifika analys som beskrivs här är anpassad från ² och ^3.

Den Drosophila hjärnan innehåller mer än 100 DA-neuroner, arrangerade i åtminstone fem olika kluster (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) som kan visualiseras i hela hjärnan monteringar genom konfokal mikroskopi (se till exempel ¹¹ och ^7). Det är fortfarande kontroversiellt huruvida antalet DA nervceller i Drosophila hjärnan avtar med åldern ^{9, 11,} men är åldersberoende neurodegeneration observerats i flugor där PD-länkade gener har muterat / overexpresseds att modellera mänskliga sjukdomarFem. Uttrycket av humant α-synuklein i DA nervceller har en sådan effekt och, följaktligen, har använts som en modell för PD. Här beskriver vi en analys för DA nervceller räknas i hela hjärnan monterar använder TH som en cell markör. Denna analys har anpassats från ¹³ och ^10.

Protocol

Ett. Startle-inducerad Negativ geotaxis Assay Välj flugor av önskad genotyp, separera dem med kön, slumpmässigt gruppera dem i kohorter av 20-30 djur och vända dem till nya livsmedel flaskor var 2-3 dagar, testa varje uppsättning av flugor (dvs. åldersmatchade kohorter, en kohort / genotyp) minst en gång i veckan. Trettio minuter innan den negativa geotaxis testet, söva flugor med CO 2 och placera dem i pre-märkta tydliga plaströr gjorda med två tomma mat injektionsfl…

Representative Results

Vi har använt de analyser som beskrivs här för att studera vilken roll stress skyddande Nrf2 väg i en Drosophila modell av PD 14. Denna modell bygger på uttrycket av den humana α-synuklein gen i DA nervceller med hjälp av en TH Gal4 förare 2, 10. Figur 1 visar ett representativt resultat av en spritta-inducerade negativa geotaxis (klättring) analys i manliga flugor som uttrycker olika transgener under kontroll av TH Gal4 föraren. Alla…

Discussion

De analyser som beskrivs här ger en användbar metod för att studera betydelsen av specifika gener, signalvägar eller små föreningar i underhållet av DA-neuroner i åldrandet samt i olika sjukdomar kopplade genetisk bakgrund (översikt i ^5).

Den spritta-inducerade negativa geotaxis beteende Drosophila har i stor utsträckning använts som en funktionell läs-out för funktionaliteten av DA-neuroner i olika genetisk bakgrund, särskilt i närvaro av PD-kopplade mutat…

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
			Equipment
Polystyrene vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digital camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optical Zoom
Glass coverslips no. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glass coverslips no. 2	VWR	48368-040	Size: 18 x 18 mm
Dissection dishes	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Size: 30 mm O.D.
Dumostar No. 5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocal microscope	Leica	SP2 or SP5 (model)

Materials Table.