Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em> Drosophila</em> Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün
Summary
Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri tarif<em> Drosophila</em>: Tırmanma / DA nöronları dejenerasyon ve tüm beyin bağlar DA nöronlar belirlemek ve saymak için kullanılan tirozin hidroksilaz immün işlevsel etkilerini incelemek için izin verir irkilme-kaynaklı negatif geotaxis testi.
Abstract
Drosophila melanogaster sinir sisteminde yaşlanma ve patolojik dejeneratif süreçleri incelemek için değerli bir model organizmadır. Deneysel bir sistem olarak sinek avantajları kendi genetik tractability, kısa yaşam süresi ve gözlemlemek ve kantitatif karmaşık davranışları analiz imkanı içerir. Drosophila beynin belirli bir nöron popülasyonları hastalık bağlantılı genlerin ifadesi, Parkinson ve Alzheimer 5 insan nörodejeneratif hastalıklar modellemek için de kullanılabilir.
Dopaminerjik (DA) nöronlar yaşlanma insan beyninde en savunmasız nöron popülasyonları arasında yer almaktadır. Parkinson hastalığında (PH), en sık görülen nörodejeneratif hareket bozukluğu, DA nöron hızlandırılmış kaybı lokomotor fonksiyon ilerleyici ve geri dönüşü olmayan bir düşüşe yol açar. Yaş ve çevresel toksinler ek olarak, DA nöronların kaybı kodlama spesifik mutasyonlar şiddetlenirçeşitli genlerin veya organizatörü bölgeleri. Örneğin PD-ilişkili alellerinin belirlenmesi in vivo DA nöronların nörodejenerasyon incelemek için bir model olarak Drosophila kullanımı için deneysel olarak içerir. Örneğin, Drosophila DA nöronlar özetler, insan hastalığı bazı özellikleri, DA nöronların sürekli bir şekilde azalması gibi ve azalan lokomotor fonksiyonunu 2 PD-bağlantılı insan α-sinüklein geninin ifadesi. Buna göre, bu model başarılı PH 8 potansiyel terapötik hedefleri tespit etmek için kullanılmıştır.
Tüm yetişkin beyin irkilme-kaynaklı olumsuz geotaxis tepki ve tirozin hidroksilaz immün dayalı bir tırmanma testi DA nöron sayısı izlemek için bağlar: Burada sık Drosophila DA nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kullanılmıştır iki deneyleri tarif farklı yaşlarda. Her iki durumda da, UAS t in vivo sentezlenmesiniDA spesifik nöronlarda ransgenes bir tirosin hidroksilaz (TH) promotör-Gal4 sürücüsü satır 3, 10 kullanılarak elde edilebilir.
Introduction
Burada açıklanan testlerin özgüllüğü dopaminerjik nöronların 3 spesifik ekspresyon elde etmek için tirozin hidroksilaz geninin düzenleyici sekansları yararlanan bir Gal4 sinek hattının kullanımına dayanır. Tirozin hidroksilaz, dopamin sentezinde ilk ve oran-sınırlayıcı aşama katalize eder. In vivo DA nöronların (örnek 6 bakınız) tanımlamak için uygun bir aday TH yapma dopamin ile, o, yetişkin sinek beyin örtüşmekte TH immünoreaktivite. Ayrıca, THGal4 salgılama modelini dopa dekarboksilaz gen ayarlayıcı sıralan içerir ve DA nöronlarda sadece transgenik ekspresyonu sağlayan bu DdcGal4 gibi diğer Gal4 hatları, bu daha spesifik olan, ama aynı zamanda 3 glial hücreler serotonerjik nöronların alt gruplarında .
Feany ve Bender (2000) ilk PD-bağlantılı insan α-sinüklein geninin pan-nöronal ifade sta en ilerici kaybını hızlandırır görülmektedirDrosophila rtle bağlı olumsuz geotaxis davranış. Biz expressionof bir α-sinüklein transgen 10 sürücü DA-nöron spesifik THGal4 satırını kullanarak benzer sonuçlar gözlenmiştir ve bu Nrf2 yolunun nöroprotektif rolünü incelemek için bu fonksiyonel Okuması kullanmış PD 14 Drosophila modeli. Burada açıklanan belirli tahlil 2 ve 3 uyarlanmıştır.
Drosophila beyin (örneğin 11 ve 7 için bakınız) konfokal mikroskopi ile tüm beyin bağlar görselleştirilebilir en az 5 farklı topakçıklar halinde düzenlenmiş olan birden fazla 100 da nöronlar (PPL1, PPL2, PAL PPM1 / 2, PPM3) içerir. Ancak, yaşa bağlı nörodejenerasyon PD-bağlantılı genler mutasyona uğramış nerelerde sinekler gözlenen / insan hastalıkları modellemek için aşırı eksprese değil, 9 yaşında, 11 ile Drosophila beyin düşüşler DA nöron sayısı olup olmadığını hala tartışmalıdır5. DA nöronlarda insan α-sinüklein ifadesi gibi bir etkisi vardır ve bu nedenle, PD için bir model olarak kullanılmıştır. Burada DA nöronlar hücre belirteci olarak TH kullanarak bağlar tüm beyin saymak için bir test tarif. Bu deney, 13 ve 10 den adapte edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deneyleri farklı hastalık bağlı genetik arka (5 yorumlanan) yanı sıra yaşlanma DA nöronların bakım yolları veya küçük bileşikleri sinyal, belirli genlerin rolü incelemek için yararlı bir yaklaşım sağlamak Burada anlatılan.
Drosophila irkilme indüklenen Negatif geotaxis davranış bu yöntem özellikle PD-bağlantılı mutasyonlar varlığında farklı genetik arka bölgesi DA nöronların işlevselliği için Okuması işlevsel olarak kullanılmış…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yararlı tartışmalar için teknik yardım ve Gerasimos P. Sykiotis için, sinek hisse senetleri için Christine Sommers Leo Pallanck teşekkür ederim. Bu çalışma MCB için NIH eğitim bursu T32CA009363 tarafından finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) |
Materials Table.
References
- Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson’s disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
- Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson’s Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
- Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
- Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson’s disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson’s disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).
