설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법
Summary
기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한 쉽고 안정적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.
Abstract
점막 섬모 정리 기능에 대한 통찰력을위한 중요한 운동성 섬모 기능의 정량적 분석을위한 영상 마우스의기도 상피 세포에 대한 생체 기술이 설립되었습니다. 갓 수확 마우스 기관은 trachealis 근육을 세로로 잘라 유리 바닥 접시에 얕은 벽 챔버에 장착된다. 기관의 샘플은 길이 방향으로 컬하는 trachealis 근육을 활용하기 위해 긴 축을 따라 배치됩니다. 이 전체 기관 길이에 따라 프로필보기 섬모 운동의 이미지를 수 있습니다. 200 프레임 / 초의 영상은 섬모 비트 주파수와 섬모 파형의 정량 분석을 할 수 있도록 차등 간섭 대비 현미경과 고속 디지털 카메라를 사용하여 얻을 수 있습니다. 영상 중에 형광 구슬의 추가와 함께, 섬모 발생 유량도 측정 할 수 있습니다. 프로토콜 시간은 챔버 준비를위한 5 분에서 약 30 분, 샘플에 대한 5-10 분에 걸쳐설치 및 videomicroscopy 10 ~ 15 분.
Introduction
기도 상피 세포의 운동성 섬모 기능의 분석은 점막 섬모 통관 및 폐 건강 한 영향을 미칠 수있는 유전과 환경 요인을 해명 실험적으로 중요합니다. 영상에 마우스기도 상피를 위해 개발 된 간단한 프로토콜은 돌연변이와 녹아웃 마우스 모델에서기도 섬모 운동을 심문하는 효율적인 방법을 제공하고 마우스 기관 조직의 절개와 높은 해상도 videomicroscopy와기도 섬모 운동의 생체 이미징는 기본 기술을 필요로합니다. 이 프로토콜은 이소성 2-5과 관련된 선천성 심장 질환을 가진 돌연변이의 운동성 섬모 기능의 신속한 평가 (속눈썹 비트 주파수, 섬모 구타 모양, 속눈썹 생성 흐름)을 허용하는 대규모 마우스 돌연변이 화면 중에 설립 세련된.
기도 섬모 운동을 연구하는 데 사용되는 현재의 기술은 급성 전 생체 유형 또는 경도 하나에 그룹화 할 수 있습니다체외 실험 방법의 GER 용어입니다. 급성 실험은 생체 인간 코 /기도 브러시 생검의 시각화 6,7 간단한 가로기도 섹션 8의 분석을 포함. 체외 방식은 공기 액체 인터페이스를 문화 나기도 현탁 배양 9-11에서와 같이 차별화 된 섬모 상피의 시트를 생성하는 다양한 세포 배양 기술을 활용합니다. 모든 사용 가능한 섬모 상피 세포가 실험 (4-6주 9,10)에 대해 생성되기 전에 그러나, 이러한기도 상피 reciliation 기술은 시간과 교육에서 매우 중요한 투자를 필요로합니다. 기도 상피 브러시 생검의 급성 전 생체 분석은 일반적으로 인간의 임상 연구에 사용하고 있지만,이 방법은 더욱 악화 기계적 조직 손상 12에 의한 마우스 연구에서 사용할 수 없습니다.
양해 각서 (MOU)의 분석을 위해이 프로토콜에 설명 된 기술E 기관기도 상피 실행할 단순 아니지만, 그것은 특별한 해부 기술도 videomicroscopy하여 이미징을위한 그 표준 이외의 특수 장비 전혀 필요하지 않습니다. 이 간단한 프로토콜에 많은 장점이 있습니다. 마우스 기관 조직 수확을 실시 할 빠르고 쉽기 때문에 첫째, 그것은 쥐의 큰 숫자기도 섬모 기능의 신속한 평가를 위해 수 있습니다. 이 체외 치료 다른의 단기 효과 급성 분석을 포함 할 수 있습니다. 둘째, 생체 기술되고, 섬모기도 상피 세포는 지원 조직을 기본에 붙어 남아 있으므로 관련된 세포 신호 경로를 유지합니다. 따라서 체외 reciliated기도 상피 세포에 비해,이 혼합물은 생체 조직 환경에서 자연의 더 나은 표현입니다. 셋째,이 프로토콜을 허용 운동성 섬모 F의 객관적인 평가를 제공 할 수있는 다른 양적 변수의 숫자의 취득기름 부음. 마지막으로,기도 섬모 시각화를위한 다른 현재의 방법과는 달리,이 프로토콜은 섬모 비트의 고해상도 이미징 및 metachronal 파 생성을위한 최적 속눈썹의 프로필보기를 허용, 속눈썹 비트 방향에 직각 속눈썹의 시각화 수 있습니다 .
이 프로토콜은 이러한 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는기도 섬모 기능 및 생성 / 유지 보수 등의 점액 부하 등의 기계적 요인의 역할과 실험의 다양한 요구를 해결하기 위해 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다 기도 섬모 비트와 metachronal 파동 전파.
Protocol
Representative Results
Discussion
속눈썹 비트 주파수 측정 (CBF)는 고성능 현미경 목표와 빠른 이미지 수집 하드웨어 13,15을 사용하여 비교적 쉽고, CBF 측정은 건강과 질병 중에 점막 섬모 허가를 조사하고 대부분의 연구의 기초를 형성 이유를 설명합니다. CBF 측정 혼자 CBF의 점막 섬모 정리, 측정을 이해하기위한 필수적인 반면, 섬모 생성 흐름을 측정하기가 더 어렵 자주 무시되는 둘 중 속눈썹 비트 파형 모두의 근본적인…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소에서 NIH 교부금 U01HL098180에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 심장, 폐의 공식 견해를 대변하지 않습니다, 및 혈액 연구소 또는 국립 보건원
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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