طريقة السابقين فيفو التصوير عالية الدقة في القدرة على الحركة الأهداب في القوارض مجرى الهواء الظهارة
Summary
يوصف أسلوب سهل وموثوق بها لتصور وقياس حركية الهوائية أهداب أهداب وتدفق تم إنشاؤها باستخدام الماوس القصبة الهوائية. يمكن تعديل هذه التقنية لتحديد كيف يمكن لمجموعة واسعة من العوامل التي تؤثر على حركية الأهداب، بما في ذلك وكلاء الدوائية، والعوامل الوراثية والتعرض لعوامل بيئية، و / أو عوامل ميكانيكية مثل الحمل المخاط.
Abstract
وقد أنشئت تقنية فيفو السابقين للتصوير الماوس الهوائية ظهائر للتحليل الكمي من أهداب متحركة وظيفة مهمة لنظرة ثاقبة وظيفة التخليص مخاطي هدبي. يتم قطع المقطوع حديثا الماوس القصبة الهوائية طوليا من خلال العضلات رغامية والتي شنت في غرفة الجدران الضحلة على طبق زجاج القاع. يتم وضع عينة القصبة الهوائية على طول محورها الطويل للاستفادة من العضلات رغامية إلى حليقة طوليا. وهذا يسمح التصوير من الحركة الهدبية في الملف الشخصي على طول القصبة الهوائية بأكملها. ويتم الحصول على أشرطة الفيديو في 200 لقطة / ثانية باستخدام التدخل التفاضلية المجهري التباين وعالية السرعة كاميرا رقمية للسماح التحليل الكمي من تردد ضربات أهداب والموجي الهدبية. مع إضافة الخرز الفلورسنت أثناء التصوير، وأهداب ولدت تدفق السوائل أيضا يمكن تحديده. الوقت بروتوكول يمتد ما يقرب من 30 دقيقة، مع 5 دقائق لإعداد غرفة، 5-10 دقيقة لعينةتصاعد مستمر، و 10-15 دقيقة للvideomicroscopy.
Introduction
تحليل وظيفة أهداب متحركة في مجرى الهواء ظهائر المهم تجريبيا لتوضيح العوامل الوراثية والبيئية التي يمكن أن تؤثر التخليص مخاطي هدبي والصحة الرئوية 1. بروتوكول بسيط وضعت لتصوير الماوس الهوائية ظهائر يوفر وسيلة فعالة لاستجواب مجرى الهواء حركية الأهداب في نماذج الماوس متحولة وخروج المغلوب، وتتطلب فقط المهارات الأساسية في الماوس القصبة الهوائية تشريح الأنسجة والتصوير فيفو السابقين من الشعب الهوائية أهداب حركية مع ارتفاع videomicroscopy القرار. أنشئ هذا البروتوكول وصقلها على نطاق واسع خلال شاشة الطفرات الماوس للسماح للتقييم السريع للوظيفة أهداب متحركة (تردد فاز أهداب، شكل فوز أهداب، الأهداب تدفق ولدت) في المسوخ مع أمراض القلب الخلقية المرتبطة توضع مغاير 2-5.
ويمكن تصنيف التقنيات الحالية المستخدمة لدراسة مجرى الهواء حركية الأهداب إلى إما حادة السابقين نوع الجسم الحي أو LONGER المصطلح في مناهج تجريبية في المختبر. وتشمل التجارب الحادة التصور فيفو السابقين من الأنف / الهوائية الخزعات فرشاة الإنسان 6،7 وتحليل بسيط المقاطع الهوائية عرضية 8. النهج في المختبر استخدام مختلف تقنيات زراعة الخلايا لتوليد ورقة من ظهائر مهدبة متباينة مثل في الهواء واجهة الثقافات السائل أو مجرى الهواء الثقافات التعليق 9-11. ومع ذلك، هذه الهوائية ظهائر تقنيات reciliation تتطلب استثمارات كبيرة جدا في الوقت والتدريب قبل أن يتم إنتاج أي الخلايا الظهارية مهدبة صالحة للاستخدام لإجراء التجارب (4-6 أسابيع 9،10). في حين تحليل فيفو السابقين الحاد في مجرى الهواء الخزعات فرشاة الظهارية تستخدم عادة للدراسات اكلينيكية على البشر، وهذه الطريقة غير قابلة للاستخدام في دراسات الماوس بسبب تفاقم إصابة الأنسجة الميكانيكية 12.
هذه التقنية المبينة في هذا البروتوكول لتحليل مذكرات التفاهمه القصبة الهوائية مجرى الهواء ظهائر ليست بسيطة فقط لتنفيذ، لكنه لا يتطلب مهارات خاصة ولا تشريح أي معدات متخصصة إلى جانب تلك القياسية للتصوير بواسطة videomicroscopy. هناك العديد من المزايا في هذا البروتوكول بسيطة. أولا، لأن الحصاد الأنسجة القصبة الهوائية الفأر هو سريعة وسهلة لتنفيذ، لأنها تتيح للتقييم السريع للمجرى الهواء وظيفة الأهداب في عدد كبير من الفئران. هذا ويمكن أن تشمل تحليل حاد من الآثار على المدى القصير من مختلف العلاجات في المختبر. ثانيا، كونه تقنية فيفو السابقين، يبقى ظهارة مهدبة مجرى الهواء مرفقة به الكامنة وراء الأنسجة الداعمة وبالتالي الاحتفاظ المرتبطة الخلية مسارات الإشارات. ولذلك بالمقارنة مع مجرى الهواء في المختبر reciliated ظهائر، هذا الإعداد هو تمثيل أفضل للبيئة الطبيعية في أنسجة الجسم الحي. ثالثا، يسمح هذا البروتوكول الاستحواذ على عدد من العوامل الكمية المختلفة التي يمكن أن توفر تقييما موضوعيا لمتحركة و أهدابمرهم. أخيرا، وعلى النقيض من الأساليب الحالية أخرى لمجرى الهواء التصور أهداب، وهذا البروتوكول يسمح لتصور من أهداب في زوايا الحق في اتجاه فوز أهداب، والسماح مشاهدة الملف الشخصي للأهداب التي هي الأمثل لتصوير عالية الدقة من فوز أهداب وتوليد موجة metachronal .
هذا البروتوكول يمكن تعديلها في عدد من الطرق لمعالجة مجموعة واسعة من الاحتياجات التجريبية مثل دور وكلاء الدوائية، والعوامل الوراثية والتعرض لعوامل بيئية، و / أو عوامل ميكانيكية مثل الحمل المخاط على مجرى الهواء وظيفة الأهداب وتوليد / صيانة الهوائية أهداب فوز وmetachronal انتشار الموجات.
Protocol
Representative Results
Discussion
قياس تردد فاز أهداب (البرازيلي) من السهل نسبيا باستخدام المجهر أهداف السلطة العليا وصورة سريعة الأجهزة اكتساب 13،15، ويفسر لماذا تشكل قياسات الاتحاد البرازيلي أساس معظم الدراسات التحقيق التخليص مخاطي هدبي أثناء الصحة والمرض. ومع ذلك، في حين أن قياس البرازيلي ضر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح U01HL098180 من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد أو المعاهد الوطنية للصحة
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O’Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
