O método ex vivo para High Resolution Imaging de Motilidade Cilia em Rodent Airway Epithelia
Summary
Uma técnica simples e confiável para a visualização e quantificação das vias aéreas motilidade cílios e cílios fluxo gerado usando o mouse traquéia é descrito. Esta técnica pode ser modificado para determinar como uma ampla variedade de factores que influenciam a motilidade dos cílios, incluindo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco.
Abstract
Uma técnica ex vivo para a imagem do mouse epitélio das vias aéreas para a análise quantitativa da função dos cílios móveis importante para a introspecção em função de transporte mucociliar foi estabelecida. Recém-colhida rato traquéia é cortado longitudinalmente através do músculo traqueal e montado em uma câmara com paredes rasas em um prato de vidro de fundo. A amostra de traqueia é posicionado ao longo do seu eixo longitudinal para tirar vantagem do músculo traqueal de enrolar longitudinalmente. Isto permite que imagens de movimento ciliar na vista de perfil ao longo de todo o comprimento traqueal. Vídeos em 200 frames / seg são obtidos usando microscopia de contraste de interferência diferencial e uma câmera digital de alta velocidade para permitir a análise quantitativa da frequência do batimento ciliar e de forma de onda ciliar. Com a adição de partículas fluorescentes durante a imagem, o fluxo de fluido gerado pestanas também podem ser determinados. O tempo de protocolo abrange cerca de 30 min, com 5 min para a preparação de câmara, 5-10 min para a amostramontagem e 10-15 minutos para videomicroscopia.
Introduction
Análise da função cílios móveis no epitélio das vias aéreas é experimentalmente importante para a elucidação dos fatores genéticos e ambientais que podem afetar o transporte mucociliar e saúde pulmonar 1. O protocolo simples desenvolvido para a imagem com o mouse epitélio das vias aéreas fornece um método eficiente para interrogar a motilidade dos cílios das vias aéreas em modelos mutantes e nocaute do mouse e exigem apenas conhecimentos básicos de rato dissecação do tecido traqueal e de imagem ex vivo da motilidade dos cílios das vias aéreas, com alta videomicroscopia resolução. Este protocolo foi criado e aperfeiçoado durante uma tela de mutagênese em larga escala do mouse para permitir uma avaliação rápida da função cílios móveis (freqüência de batimento dos cílios, cílios batida forma, o fluxo gerado cílios) em mutantes com doença cardíaca congênita associada heterotaxy 2-5.
As técnicas atuais utilizadas para estudar a motilidade dos cílios das vias aéreas podem ser agrupados em um ou outro do tipo ex vivo aguda ou lontermo ger em abordagens experimentais in vitro. Experimentos agudos incluem a visualização ex vivo de nasais / vias aéreas biópsias escova humanos 6,7 e análise de seções transversais das vias respiratórias simples 8. As aproximações in vitro utilizam várias técnicas de cultura de células para gerar folhas de epitélios ciliados diferenciado tal como em culturas de interface líquido das vias aéreas ou culturas em suspensão de 9-11. No entanto, estas técnicas reciliation epitélios das vias aéreas requerem um investimento muito significativa no tempo de formação e antes de quaisquer células epiteliais ciliadas utilizáveis são produzidos por experimentação (4-6 semanas 9,10). Enquanto a análise ex vivo aguda das vias aéreas de biópsias da escova epiteliais são comumente utilizados em estudos clínicos humanos, este método não pode ser utilizado em estudos de rato, devido à lesão do tecido exacerbada mecânico 12.
A técnica descrita neste protocolo para análise do moustraqueal epitélio das vias aéreas e não é apenas simples de executar, mas não requer habilidades especiais de dissecação, nem qualquer equipamento especializado, além daqueles padrão para imagens por videomicroscopia. Há muitas vantagens para este protocolo simples. Em primeiro lugar, como o rato traqueia colheita tecidual é rápido e fácil de realizar, que permite a avaliação rápida da função dos cílios das vias respiratórias em um grande número de ratinhos. Isto pode incluir a análise aguda dos efeitos a curto prazo de diferentes tratamentos na in vitro. Por outro lado, sendo uma técnica ex vivo, o epitélio das vias respiratórias ciliado permanece ligada a ela subjacente e tecidos de suporte, assim, conservar as vias de sinalização celulares associadas. Portanto, em comparação com reciliated no epitélio das vias respiratórias in vitro, esta preparação é a melhor representação do ambiente natural no tecido in vivo. Em terceiro lugar, este protocolo permite a aquisição de um número de diferentes parâmetros quantitativos que podem fornecer a avaliação objetiva de móveis cílios função. Finalmente, em contraste com outros métodos actuais para a visualização dos cílios das vias aéreas, este protocolo permite a visualização dos cílios, perpendicularmente à direcção batimento ciliar, o que permite ver o perfil dos cílios, que é óptimo para imagens de alta resolução dos batimentos dos cílios e geração de onda de metachronal .
Este protocolo pode ser modificado num certo número de maneiras de lidar com uma vasta gama de necessidades experimentais, tais como o papel de agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco das vias respiratórias em função dos cílios e geração / manutenção batimento dos cílios das vias aéreas e propagação de ondas metachronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medição da frequência do batimento ciliar (CBF) é relativamente fácil, utilizando objetivos microscópio de alta potência e de hardware de aquisição de imagem rápida 13,15, e explica por que as medições CBF formam a base da maioria dos estudos que investigam a depuração mucociliar durante a saúde ea doença. No entanto, enquanto a CBF medição é essencial para compreender a depuração mucociliar, medição da CBF sozinho ignora a importância fundamental de ambos ciliar fluxo gerado e batimen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O projeto foi financiado pelo NIH conceder U01HL098180 do National Heart, Lung, and Blood Institute. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos seus autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do National Heart, Lung, and Blood Institute e do National Institutes of Health
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O’Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
