Ex Метод естественных условиях для высокого разрешения подвижность ресничек у грызунов эпителия дыхательных путей
Summary
Простой и надежный способ для визуализации и количественной дыхательных путей подвижность ресничек и реснички создан поток с помощью мыши трахеи описано. Этот способ может быть модифицирован, чтобы определить, как широкий спектр факторов, влияющих реснички подвижность, в том числе фармакологические агенты, генетические факторы, воздействия окружающей среды и / или механических факторов, таких как слизь нагрузки.
Abstract
Бывших естественных условиях технику для работы с изображениями мыши эпителия дыхательных путей для количественного анализа подвижных функция ресничек важно для понимания функции мукоцилиарного клиренс был создан. Свежесобранных мыши трахею разрезают в продольном направлении через trachealis мышц и установлен в мелкой стенами палаты по стеклянным дном блюда. Образец трахеи, расположенных вдоль его продольной оси, чтобы воспользоваться trachealis мышц к скручиванию в продольном направлении. Это дает возможность получить изображение цилиарной движения в виде профиля по всей длине трахеи. Видео со скоростью 200 кадров / сек получены с использованием дифференциального интерференционного контрастной микроскопии и высокоскоростные цифровые камеры, чтобы позволить количественного анализа ресничек частота биений и цилиарного сигнала. С добавлением флуоресцентные шарики во время съемки, реснички генерируется поток жидкости также может быть определена. Протокол отрезки времени около 30 мин, всего 5 мин для приготовления камере, 5-10 мин для образцамонтаж, и 10-15 мин для видеомикроскопии.
Introduction
Анализ функции подвижных ресничек эпителия дыхательных путей экспериментально важно для выяснения генетических и экологических факторов, которые могут повлиять мукоцилиарный клиренс и легочной здоровья 1. Простой протокол, разработанный для работы с изображениями мыши эпителия дыхательных путей обеспечивает эффективный способ, чтобы допросить подвижность ресничек в дыхательных путях мутанта и нокаут модели мыши и требуются только базовые навыки в мышь рассечение тканей трахеи и бывших естественных изображений ресничками дыхательных путей с высокой подвижностью видеомикроскопии разрешение. Этот протокол был создан и уточняться в ходе крупномасштабной экрана мутагенеза мыши для обеспечения быстрой оценки функции подвижные реснички (частота реснички бить, бить форму реснички, реснички создан поток) у мутантов с врожденными пороками сердца, связанных с heterotaxy 2-5.
Современные методы используются для изучения подвижности ресничек дыхательных путей могут быть сгруппированы либо в естественных условиях острого типа бывших или LONGER термин в пробирке экспериментальных подходов. Острых опытах, последующую визуализации естественных носа человека / дыхательных путей биопсии кистью 6,7 и анализ простых поперечных срезов дыхательных путей 8. В пробирке подходы используют различные методы клеточной культуры для создания листов мерцательного эпителия дифференцированных например в воздухе жидких культур интерфейса или дыхательных путей суспензионных культур 9-11. Однако эти методы эпителия дыхательных путей reciliation требуют очень значительных затрат времени и подготовки, прежде чем какая-либо полезная мерцательного эпителия клетки производятся для экспериментов (4-6 недели 9,10). В то время как анализ естественных условиях острой Ех эпителия дыхательных путей биопсии кисти обычно используются для человека клинические исследования, этот метод не может использоваться в исследованиях на мышах усугубляется из-за механического повреждения тканей 12.
Техники, изложенные в настоящем Протоколе для анализа МОВэлектронной трахеи эпителия дыхательных путей не только простых для исполнения, но это не требует никаких специальных навыков вскрытия, ни специального оборудования, кроме тех, стандартных для работы с изображениями на видеомикроскопии. Есть много преимуществ для этого простой протокол. Во-первых, как ткани мыши трахеи урожай быстро и легко выполнить, оно позволяет для быстрой оценки функции ресничек дыхательных путей в большом количестве мышей. Это может включать острое анализ краткосрочных эффектов различных в пробирке лечения. Второй, будучи бывшим технику естественных условиях, мерцательного эпителия дыхательных путей остается прикрепленным к нему, лежащих в основе опорных тканей и, следовательно, вести соответствующие клеточных сигнальных путей. Поэтому по сравнению с в пробирке reciliated эпителия дыхательных путей, этот препарат является лучшим представлением естественной среды в ткани естественных условиях. В-третьих, этот протокол позволяет приобретение целого ряда различных количественных параметров, которые могут обеспечить объективную оценку подвижные реснички Fпомазание. Наконец, в отличие от других современных методов для визуализации ресничками дыхательных путей, этот протокол позволяет выводить реснички под прямым углом к направлению удара реснички, позволяющий вид профиля реснички, оптимальные для получения изображения с высоким разрешением реснички избили и метахрональная поколения волны .
Этот протокол может быть модифицирован различными способами для решения широкого круга экспериментальных потребностей, таких как роли фармакологических агентов, генетические факторы, воздействия окружающей среды и / или механических факторов, таких как слизь нагрузки на функции дыхательных путей реснички и генерации / поддержание дыхательных путей бить ресничек и метахрональная распространения волны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Измерение частота биений ресничек (CBF) относительно легко Использование мощных микроскопа цели и быстро аппаратного захвата изображений 13,15, и объясняет, почему CBF измерений основой Большинство исследований с целью мукоцилиарный клиренс во здоровья и болезни. Тем не менее, в то в?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект был поддержан грантом NIH U01HL098180 от Национального сердца, легких и крови институт. Материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального сердца, легких и крови институт или Национального института здоровья
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O’Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
