설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

요약

기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

초록

점막 섬모 정리 기능에 대한 통찰력을위한 중요한 운동성 섬모 기능의 정량적 분석을위한 영상 마우스의기도 상피 세포에 대한 생체 기술이 설립되었습니다. 갓 수확 마우스 기관은 trachealis 근육을 세로로 잘라 유리 바닥 접시에 얕은 벽 챔버에 장착된다. 기관의 샘플은 길이 방향으로 컬하는 trachealis 근육을 활용하기 위해 긴 축을 따라 배치됩니다. 이 전체 기관 길이에 따라 프로필보기 섬모 운동의 이미지를 수 있습니다. 200 프레임 / 초의 영상은 섬모 비트 주파수와 섬모 파형의 정량 분석​​을 할 수 있도록 차등 간섭 대비 현미경과 고속 디지털 카메라를 사용하여 얻을 수 있습니다. 영상 중에 형광 구슬의 추가와 함께, 섬모 발생 유량도 측정 할 수 있습니다. 프로토콜 시간은 챔버 준비를위한 5 분에서 약 30 분, 샘플에 대한 5-10 분에 걸쳐설치 및 videomicroscopy 10 ~ 15 분.

서론

기도 상피 세포의 운동성 섬모 기능의 분석은 점막 섬모 통관 및 폐 건강 ^{한 영향을} 미칠 수있는 유전과 환경 요인을 해명 실험적으로 중요합니다. 영상에 마우스기도 상피를 위해 개발 된 간단한 프로토콜은 돌연변이와 녹아웃 마우스 모델에서기도 섬모 운동을 심문하는 효율적인 방법을 제공하고 마우스 기관 조직의 절개와 높은 해상도 videomicroscopy와기도 섬모 운동의 생체 이미징는 기본 기술을 필요로합니다. 이 프로토콜은 이소성 ^2-5과 관련된 선천성 심장 질환을 가진 돌연변이의 운동성 섬모 기능의 신속한 평가 (속눈썹 비트 주파수, 섬모 구타 모양, 속눈썹 생성 흐름)을 허용하는 대규모 마우스 돌연변이 화면 중에 설립 세련된.

기도 섬모 운동을 연구하는 데 사용되는 현재의 기술은 급성 전 생체 유형 또는 경도 하나에 그룹화 할 수 있습니다체외 실험 방법의 GER 용어입니다. 급성 실험은 생체 인간 코 /기도 브러시 생검의 시각화 ^6,7 간단한 가로기도 섹션 ^8의 분석을 포함. 체외 방식은 공기 액체 인터페이스를 문화 나기도 현탁 배양 ^{9-11에서와}

프로토콜

1. 시약 설정

1.1 해부 및 영상 매체

Leibovitz의 L-15 배지 (L15)는 기관 샘플 수확 및 이미징을 수행하는 동안 사용되는 FBS (10 %)과 페니실린 - 스트렙토 마이신 (100 단위 / 페니실린 G 나트륨과 스트렙토 마이신 황산염 100 ㎍ / ㎖의 ML)로 보충된다.

2. 얕은 벽으로 둘러싸인 문화 챔버 어셈블리

기관 조직을 보유하는 데 사용되는 챔버는 그림 1에 표시됩니다. 챔버의 바닥은 유리 35mm 배양 접시 바닥이다. 챔버의 상단과 측면이 유리 접시 위에 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 작은 조각을 배치하여 생성됩니다. 시트의 가장자리가 둥근 바닥 요리에 맞게 절단 및 센터는 추가 (단계 2.1-2.3 참조) 얕은 중앙 챔버를 형성하기 위해 트림합니다. 이 어셈블리의 상단에, 18mm의 둥근 유리 커버 슬립이 영상에 적합한 밀폐 챔버를 생성하기 위해 배치됩니다.

1. 완전히 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 사각형 18mm 원형 유리 커버 슬립을 포함한다.
2. 표준 날카로운 해부 가위 커버 슬립 (실리콘....

결과

동영상 재생 100 %, 속눈썹 비트 (보충 영화 2의 방향으로 눈에 띄는 흐름; 통제기도 섬모가 명확하게 볼과 조정 방법 (동영상 재생이 15 % 실시간으로 느려집니다 보충 영화 1)에서 이길 볼 수 있어야합니다 ) 시간 진짜. 섬모 영화의 정량은 그림 3에서 본 것과 유사한 결과를 얻을 수 있어야합니다. 형광 구슬의 추적 섬모 생성 유속의 측정 (그림 3D)을 허용하면서 고속 DIC 영화 컬렉션은 가능한 속눈썹 비트 주파수 (그림 3C)의 정량을하고 섬모 구타 모양의 질적 평가에 대한 좋은 이미지를 제공합니다 및 방향성 (그림 3E).

우리는 선형 흐름의 인덱스를 제공하기 위해 방향성을 사용합니다. 방향성은 형광 구슬 (즉, 최단으로 여행의 총 변위로 나누어 계산거리 추적의 시.......

토론

속눈썹 비트 주파수 측정 (CBF)는 고성능 현미경 목표와 빠른 이미지 수집 하드웨어 ^13,15을 사용하여 비교적 쉽고, CBF 측정은 건강과 질병 중에 점막 섬모 허가를 조사하고 대부분의 연구의 기초를 형성 이유를 설명합니다. CBF 측정 혼자 CBF의 점막 섬모 정리, 측정을 이해하기위한 필수적인 반면, 섬모 생성 흐름을 측정하기가 더 어렵 자주 무시되는 둘 중 속눈썹 비트 파형 모두의 근본적인 중요성을 무시하고 CBF와 연관되지 않을 수 있습니다. CBF 증가 섬모 생성 흐름과 일치하지 않을 수도 증가하는 방법의 예는 DNAH11 돌연변이를 가진 일부 환자에서 볼 수 있습니다. DNAH11는 axonemal dynein 중쇄 단백질, 모두 hyperkinetic (빠른) 섬모 비트와 점막 섬모 정리 ¹⁶ 문제를 일으킬 것으로 예상되는 비정상적인 섬모 비트 파형을 일으키는 것으로보고 된 어떤 돌연변이입니다. significa우리의 프로토콜 NT의 장점은 섬모 구타 모양과 속눈썹의 고해.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
레보비츠' s L-15 Medium	Invitrogen	21083-027	페놀 레드
태아 소 혈청	Hyclone	SH30088.03
페니실린-스트렙토마이신	Invitrogen	15140-122
2x 미세 집게	Roboz	RS-4976
해부 가위	Roboz	RS-5676
마이크로 해부 가위	Roboz	RS-5620
메스	Roboz	RS-9801-15
P1000 피펫맨	Gilson, Inc	F123602
P1000 팁	Molecular BioProducts	2079E
18mm 원형 유리 커버 슬립	Fisher Scientific	430588
플라스틱 35mm 배양 접시	Corning	430588
유리 바닥 35mm 배양 접시	워너 인스트루먼트	W3 64-0758
실리콘 시트 0.012" (0.3 mm) 두께	의 AAA Acme Rubber Co	CASS-.012X36-63908
0.20 μ m 직경 Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	09834-10
도립 현미경, 100x 오일 대물렌즈 및 DIC 필터	Lecia	DMIRE2	브랜드는 중요하지 않습니다.
100와트 수은 램프, 에피 형광 FITC 여기/방출 필터	Lecia		브랜드는 중요하지 않습니다.
현미경 스테이지 인큐베이터	Lecia	11521749	실온에서 섬모를 이미징하는 경우 필요하지 않음
고속 카메라 명시야	Vision Research	Phantom v4.2	브랜드가 중요하지 않습니다. 125fps보다 빨라야 합니다
고속 형광등 카메라	Hamamatsu	C9100-12	브랜드는 중요하지 않습니다. 10fps보다 빨라야 합니다
영화 분석 소프트웨어	National Institutes of Health	ImageJ(MtrackJ 플러그인

. 포함)