قياس الكالسيوم داخل الخلايا^{2 +} التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

Summary

الكالسيوم داخل الخلايا^{2 +} ديناميات هي مهمة جدا في علم وظائف الأعضاء الحيوانات المنوية والكالسيوم^{2 +} حساسة الأصباغ الفلورية تشكل أداة مرنة لدراستها. وتستخدم التجارب السكان (قياس التألق وتوقف تدفق قياس التألق) والتجارب خلية واحدة (التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة) لتعقب المكانية والزمانية [كا^{2 +}] تغيرات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية.

Abstract

الحيوانات المنوية هي خلايا التناسلية للذكور صمم خصيصا للوصول والتعرف عليها وتندمج مع البيضة. لأداء هذه المهام، الخلايا المنوية يجب أن يكون مستعدا لمواجهة بيئة متغيرة باستمرار والتغلب على العديد من الحواجز المادية. يجري في جوهر transcriptionally وtranslationally صامتة، وهذه الخلايا متحركة تعتمد بشكل كبير على آليات متنوعة مما يشير إلى توجيه نفسها والسباحة بطريقة موجهة، ويتعامل مع ظروف بيئية قاسية خلال رحلتهم للبحث عن البيض. على وجه الخصوص، كا ^{2 +} إشارات بوساطة أمر حيوي لعدة وظائف الحيوانات المنوية: تفعيل الحركة، وتمكين الطاقات (عملية معقدة التي تعد الحيوانات المنوية للتفاعل الجسيم الطرفي) وردود الفعل الجسيم الطرفي (حدثا exocytotic التي تسمح الانصهار الحيوانات المنوية البيضة). استخدام الأصباغ الفلورية لتتبع تقلبات الخلايا من أيون هذا له أهمية ملحوظة نظرا لسهولة تطبيقها، والحساسية، وبراعة ديتection. باستخدام بروتوكول واحد واحد صبغ التحميل نستخدم أربع تقنيات مختلفة لمراقبة فلوروميتريك الحيوانات المنوية كا ^{2 +} ديناميات. يوفر كل تقنية المعلومات المتميزة التي تمكن القرار المكانية و / أو الزماني، وتوليد البيانات سواء في خلية واحدة ومستويات السكان الخلية.

Introduction

كا ^{2 +} هو رسول الثاني العالمي لمسارات نقل الإشارة في الخلايا حقيقية النواة. داخل الخلايا كا ^{2 +} (كا ^{2 +} _ط) يشارك في تنظيم العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية في الخلايا على حد سواء منفعل وغير منفعل. مشتق أهمية وعالمية كا ^{2 +} كرسول الثانية خلال الأحداث نقل الإشارة من تنوعها المكانية والزمانية في نقل المعلومات داخل الخلية. بينما كا ^{2 +} لا يمكن توليفها من جديد أو المتدهورة داخل الخلية، وتركيزه داخل الخلايا ([كا ^{2 +]} _ط) يتم الاحتفاظ ضمن حدود صارمة للغاية من خلال الآليات الخلوية المختلفة التي العازلة بشكل مستمر، تنحية، تجزئة، و / أو تتراكم كا ^{2 +.} يمكن أن تحدث تغييرات في تركيز أيون في هذه المناطق المترجمة للغاية داخل الخلية ^1، وفك رموز هذه التقلبات أمر ضروري لاكتساب ديفهم EPER من (1) دورهم في آلية يشير، (2) أهميتها الفسيولوجية، و (3) آليات العام للإشارة الخلية. كا ^{2 +} إشارات بوساطة له أهمية خاصة في علم وظائف الأعضاء الحيوانات المنوية ^2. الحيوانات المنوية على الحركة هي واحدة من أهم وظائف للنجاح الإخصاب، في واقع الأمر، يمكن أن العديد من العيوب الحيوانات المنوية على الحركة يسبب العقم ^3-5. أهمية الكالسيوم ^{2 +} في حركة سوطي وقد أدركت منذ فترة طويلة ^6، ولكن آلية لكيفية كا ^{2 +} يتحكم في شكل محدد من أشكال سوطي الانحناء ليست مفهومة تماما.

قبل التفجير مع البويضة، يجب أن تخضع الحيوانات المنوية وتمكين الطاقات، وهي عملية معقدة تعتمد على الإقامة الحيوانات المنوية داخل المسالك الإناث. خلال تمكين الطاقات، يتم تعديل بنية الدهون غشاء الحيوانات المنوية ومنظمة، وذلك أساسا نتيجة لإزالة الكوليسترول من غشاء البلازما. بالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتينات هي التيروزين-الفوسفورylated ^7. الأهم من ذلك، خلال تمكين الطاقات هناك زيادة في درجة الحموضة داخل الخلايا (درجة الحموضة _ط) و في [كا ^{2 +]} _ط، وhyperpolarizes غشاء المحتملة في بعض الأنواع ^2. تمكين الطاقات يستغرق سوى مكان في جزء من السكان من الحيوانات المنوية (20-40٪)، والآليات التي تشارك في كل هذه التغيرات الخلوية لا تزال بعيدة عن الوضوح. ومن المسلم به عموما أن فقط جزء من السكان من الحيوانات المنوية باكتسابها الخضوع لتفاعل الجسيم الطرفي (AR) عندما تتعرض لفائف الفسيولوجية. ع هو أيضا كا ^{2 +} حدث التنظيم المطلوب للإخصاب في جميع الأنواع امتلاك الجسيم الطرفي (عضية المتخصصة مع الأغشية الخارجية والداخلية). خلال هذه العملية الصمامات غشاء الجسم الطرفي الخارجي مع غشاء البلازما المنوية، والإفراج عن الانزيمات حلمهي التي تسمح للخلية الحيوان المنوي على اختراق مصفوفة غليكو-البروتينية المحيطة البيض (المنطقة الشفافة، أو ZP). أيضا يعرض AR جديدة fusogenic الحيوانات المنوية سطح الخلية التي تتفاعل معغشاء البلازما البيض للانصهار النهائي كل من الأمشاج. هناك عدة بروابط الخلوية التي تحفز AR، البروجسترون كونها واحدة من أكثر درس فيما بينها.

في هذا العمل نقدم أربع تقنيات مختلفة تنطوي على استخدام كا ² صبغة الفلورسنت حساسة ⁺ لقياس [كا ^{2 +]} _ط التغيرات في الحيوانات المنوية البشرية الناجمة عن البروجسترون (باستثناء التدفق الخلوي، الذي قمنا بقياس [كا ^{2 +} ] _أنا يسببها زيادة خلال عملية تمكين الطاقات في المختبر). في هذه الحالة بالذات كنا فلوو-3 AM (الحياة تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك)، صبغة نفاذية الغشاء مع K _د = 325 نانومتر. في المختبر فإننا رصد التغيرات مضان بوصفها وظيفة من الوقت مع ثلاثة من المنهجيات، ومع تقنية الرابع قمنا بقياس القيم مضان في نقطة واحدة معينة من الزمن. هذه المقاربات المختلفة تكمل بعضها البعض، تماما منذ أنها توفر الدقة المكانية والزمانيةolution في كل من خلية واحدة ومستويات السكان الخلية.

السكان الخلية أو التجارب السائبة

وتستخدم تقنيات السائبة على نطاق واسع ليس فقط لأن الصكوك التي تتطلب متوفرة بسهولة، ولكن أيضا لأنها بسيطة، راسخة، والسماح للفي المتوسط ​​من المعلومات من القياسات التي أجريت على ملايين الخلايا في تجربة واحدة.

تقنية # 1. قياس التألق التقليدية
هذه التقنية تراقب التغيرات في مضان بوصفها وظيفة من الزمن؛ يتم تنفيذ التجارب في cuvettes الزجاج مع حجم العينة تتراوح ما بين 200 إلى 1،000 ميكرولتر. الخلط السليم من الكواشف وأضاف يتطلب التحريك المغناطيسي، وبالتالي فإن القرار الزماني حصلنا عليها في ترتيب ثواني. نموذجية خلية تركيز مجموعة من العينات التي تم تحليلها هي 10 ⁵ -10 ⁸ خلية / مل.

تقنية # 2. توقف تدفق قياس التألق
Tأسلوبه أيضا تراقب التغيرات في مضان بوصفها وظيفة من الوقت، ولكن الكواشف بسرعة تختلط معا (باستخدام ضغط) في كفيت تسجيل يحتوي على حجم عينة صغيرة جدا (تتراوح 25-100 ميكرولتر). ولذلك، تجانس الكواشف بشكل فوري، مما يتيح قرار زمنية عالية في ترتيب ميلي ثانية. تحليل مضان مقابل الوقت مما آثار هي مناسبة لتحديد معدلات التفاعل، توضيح مدى تعقيد آلية رد الفعل، والحصول على معلومات عن رد فعل وسيطة لم يدم طويلا، وما إلى ذلك مجموعة تركيز خلية مشتركة من العينات التي تم تحليلها هي 10 ⁵ -10 ⁷ خلية / مل.

تجارب خلية واحدة

تجارب السائبة تقرير السلوك متوسط ​​لعدد كبير من الخلايا، ومع ذلك، قد يبلغ عدد سكانها تظهر في كثير من الأحيان الخصائص غير المتجانسة التي يتم التغاضي عنها خلال هذا النوع من القياسات. وبالتالي تستخدم تقنيات خلية واحدة لتكمل المعلومات البريد التي تم الحصول عليها مع التجارب السكان الخلية.

تقنية # 3. التدفق الخلوي
وعلى الرغم من أهمية المعلومات الناتجة عن القياسات خلية واحدة، فمن المهم لتحليل عدد كبير من الخلايا من أجل منع استقراء الخاطئة من خصائص خلية محددة لشعب بأكمله. لهذا السبب، ويفضل التقنيات الإنتاجية العالية والأسلوب الأكثر شعبية هو التدفق الخلوي، التي يتم تحليلها في تقليديا 10،000 خلية لكل حالة. تمكن هذه الطريقة تحليل متعدد حدودي من السكان غير متجانسة لأنها تصنف الخلايا وفقا لحجمها (مبعثر إلى الأمام (FSC))، تحبب (مبعثر الجانب (SSC)) وكثافة مضان (وضع العلامات المحددة مع الأجسام المضادة، علامة السلامة، الخ.) ، وبالتالي توفير المعلومات عن توزيع المعلمات "لمجموعة من الخلايا. التدفق الخلوي يوفر الفوري بدلا من المعلومات التي تعتمد على الوقت ^8. إلى الأمام والجانب مبعثر القيم عيجب أيضا أن يدرج ه مفيدة أيضا لاختيار البوابة التي تشمل الخلايا ولكن يميز الحطام الخلوية، والغبار، وغيرها للحصول على قياسات مضان، مضان ضوابط السلبية والإيجابية. إذا تم استخدام قناة مضان أكثر من واحد، وهي عملية تعرف باسم التعويض يجب أن يؤديها (لمزيد من التفاصيل انظر http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). التعويض يسمح للتداخل الطيفية التمييز بين fluorophores. التدفق الخلوي كما يتيح التمييز من الخلايا الميتة، عموما عن طريق propidium تلطيخ يوديد.

تقنية # 4. التصوير خلية واحدة
المجهري هو طريقة أخرى شائعة لدراسة سلوك خلية واحدة، بل هي مناسبة تماما للدراسات التي تعتمد على الوقت وأنه يوفر أيضا القرار المكانية. والعيب الرئيسي هو أن تحليل الإنتاجية العالية ليست سوى في بداياتها في الوقت الحاضر <sتصل> 9.

Protocol

في هذه الورقة ونحن التقرير استخدام أربعة أساليب المذكورة أعلاه لقياس [كا 2 +] ط التغيرات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية. كنا البروجسترون لاشعال كا 2 + ردا على ذلك، كما يتم تأسيس جيدا أن هذا الستيرويد تنتج عابر [كا 2 +] ط زيادة في الحيوانات…

Representative Results

الشكل 1. ويوضح الرسم التخطيطي للبروتوكول تجريبي لعينة الحيوانات المنوية من خلال طريقة إعداد حمام السباحة. الخطوات الرئيسية لفصل الحيوانات الم?…

Discussion

إشارات بين الخلايا هو أمر حيوي لمعظم الأنشطة الخلوية؛ كا ^{2 +} هو رسول في كل مكان التي ترافق خلايا الثدييات في جميع أنحاء كامل حياتها، من أصلهم في التسميد، إلى نهاية دورة حياتها. في استجابة للمؤثرات مختلفة، [كا ^{2 +]} ط الزيادات، يتذبذب والنقصان مع تدوين المكاني?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml