Måling Intracellular Ca^{2 +} Ændringer i human Sperm med fire teknikker: Konventionel fluorometri, Stoppet Flow fluorometri, Flowcytometri og Single Cell Imaging

Summary

Intracellular Ca^{2 +} Dynamik er meget vigtige i sperm fysiologi og Ca^{2 +}-Sensitive fluorescerende farvestoffer udgør et alsidigt værktøj til at studere dem. Population eksperimenter (fluorometri og stoppet flow fluorometri) og encellede eksperimenter (flowcytometri og enkelt celle billeddannelse) bruges til at spore spatio-temporale [Ca^{2 +}] Ændringer i humane sædceller.

Abstract

Spermatozoer er mandlige kønsceller specielt designet til at nå ud til, anerkende og fusionere med ægget. For at udføre disse opgaver, skal sædceller være parat til at stå over for en konstant skiftende miljø og for at overvinde flere fysiske barrierer. At være i det væsentlige transskriptionelt og translationelt tavse, disse motile celler afhængige dybt på diverse signaleringsmekanismer at orientere sig og svømme i en rettet måde og for at kæmpe med udfordrende miljøforholdene i løbet af deres rejse for at finde ægget. Navnlig er ^{Ca2 +-medieret} signalering afgørende for flere sædceller funktioner: aktivering af motilitet, capacitation (en kompleks proces, der forbereder sæd for akrosome reaktion) og akrosome reaktion (en exocytotiske begivenhed, der giver sæd-æg fusion). Anvendelsen af ​​fluorescerende farvestoffer til at spore intracellulære udsving i denne ion er af bemærkelsesværdig betydning på grund af deres lette anvendelse, følsomhed og alsidighed thefdeling. Ved at bruge en enkelt farvestof-loading-protokol vi udnytter fire forskellige fluorometriske teknikker til overvågning sæd Ca ^{2 +} dynamik. Hver teknik giver forskellige oplysninger, der muliggør rumlig og / eller tidsmæssig opløsning, genererer data både på enkelt celle og celle befolkningstallet.

Introduction

Ca ^{2 +} er et universelt anden budbringer af signaltransduktionsveje i eukaryote celler. Intracellular Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) deltager i reguleringen af mange fundamentale fysiologiske processer i både overgearet og ikke-overgearet celler. Betydningen og universalitet Ca ^{2 +} som anden messenger under signaltransduktionsbegivenheder stammer fra dets spatio-temporale alsidighed i videregivelse af oplysninger i cellen. Mens ^{Ca2 +} ikke kan syntetiseres de novo eller nedbrydes inden for cellen, dets intracellulære koncentration ^{([Ca2 +]} _i) holdes inden for meget snævre grænser gennem forskellige cellulære mekanismer, der kontinuerligt puffer, udskille, inddeler og / eller akkumulere ^{Ca2 +.} Ændringer i koncentrationen af denne ion kan forekomme i stærkt lokaliserede områder i cellen ^1, og tyde sådanne udsving er afgørende for at opnå en deEPER forståelse af (1) deres rolle i signalering mekanisme, (2) deres fysiologiske betydning, og (3) generelle mekanismer cellesignalering. ^{Ca2 +-medieret} signalering er af særlig betydning i sædceller fysiologi ^2. Sædmotilitet er en af de vigtigste funktioner for befrugtning succes, og i virkeligheden kan flere sædens motilitet defekter forårsage sterilitet ^3-5. Betydningen af ^{Ca2 +} i flagellært bevægelse har længe været erkendt ^6, men er den mekanisme for, hvordan Ca ^{2 +} styrer den specifikke form af flagellært bøjning ikke fuldt forstået.

Før fusionere med ægget, skal spermatozoer gennemgå capacitation, en kompleks proces, der afhænger sperm bopæl inde i kvindelige tarmkanalen. Under capacitation bliver sæden membranens lipid arkitektur og organisation ændres, primært som følge af kolesterol fjernelse fra plasmamembranen. Derudover adskillige proteiner er tyrosin-fosforylated ^7.. Vigtigere er det, under capacitation der er en stigning i intracellulær pH (pH _i) og i [Ca ^{2 +]} _i, og membranpotentialet hyperpolariserer i nogle arter ^2. Capacitation kun foregår i en subpopulation af spermatozoer (20-40%), og de mekanismer, der er involveret i alle disse cellulære ændringer er langt fra klare. Det er almindeligt accepteret, at kun en subpopulation af capacitated sædceller undergår akrosome reaktion (AR), når de udsættes for fysiologiske induktionsspoler. AR er også en Ca ^{2 +-regulerede} arrangement kræves for befrugtning i alle arter besidder en acrosome (specialiseret organel med ydre og indre membraner). Under denne proces ydre acrosomal membran sikringer med sperm plasmamembran, hvilket frigiver hydrolytiske enzymer, der tillader sædcellen at trænge ind i glyco-proteinholdig matrix, der omgiver ægget (zona pellucida, eller ZP). AR også udsætter en ny fusogent sædcelle overflade, der interagerer medægget plasmamembranen ved den endelige fusion af begge kønsceller. Der er flere cellulære ligander som inducerer AR, progesteron er et af de mest studerede blandt dem.

I dette arbejde præsenterer vi fire forskellige teknikker indebærer anvendelse af en ^{Ca2 +-sensitive} fluorescerende farvestof for at måle ^{[Ca2 +]} _i ændringer i den menneskelige sædceller udløst af progesteron (undtagen flowcytometri, hvor vi målte ^{[Ca2 +} ] _jeg øge induceret under in vitro capacitation proces). I dette særlige tilfælde har vi brugt Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), en membran-gennemtrængelig farvestof med en _Kd = 325 nM. In vitro vi overvåges fluorescens ændringer som en funktion af tiden med tre af de metoder, og med det fjerde teknik, vi målte fluorescens værdier på et enkelt givet tidspunkt. Disse forskellige tilgange supplerer hinanden, idet de tilsammen giver rumlige og tidslige resolution på både enkelt celle og celle befolkningstallet.

Cell Befolkning eller Bulk Eksperimenter

Bulk teknikker er flittigt brugt ikke kun fordi de instrumenter kræver er let tilgængelige, men også fordi de er enkle, veletablerede, og tillader gennemsnitsberegning af oplysninger fra målinger foretaget på millioner af celler i et enkelt eksperiment.

Teknik # 1. Konventionel fluorometri
Denne teknik overvåger ændringer i fluorescens som funktion af tiden, forsøgene udføres i glaskuvetter med prøvevolumener fra 200 til 1.000 pi. Korrekt blanding af tilsatte reagenser kræver magnetisk omrøring, og derfor den tidsmæssige opnåede opløsning er i størrelsesordenen sekunder. Den typiske cellekoncentration række af de analyserede prøver er 10 ⁵ -10 ⁸ celler / ml.

Teknik # 2. Stoppet Flow fluorometri
Thans teknik overvåger også ændringer i fluorescens som funktion af tiden, men reagenserne blandes hurtigt sammen (ved hjælp af tryk) i en optagelse kuvette indeholdende en meget lille prøvemængde (spænder fra 25 til 100 pi). Derfor, homogenisering af reagenser er øjeblikkelig, muliggør en høj tidslig opløsning i størrelsesordenen millisekunder. Analyse af de resulterende fluorescens vs tid spor er egnet til bestemmelse af reaktionshastigheder, belyse kompleksiteten af reaktionsmekanisme, indhentning af oplysninger om kortvarige reaktion mellemprodukter mv Den fælles celle koncentrationsinterval af de analyserede prøver er 10 ⁵ -10 ⁷ celler / ml.

Single Cell Eksperimenter

Bulk eksperimenter rapporterer den gennemsnitlige opførsel af et stort antal celler, men kan en population ofte udviser heterogene egenskaber, der er overset i denne type målinger. Enkelt celle teknikker bruges således til at supplere the indhentet med cellepopulation eksperimenter.

Teknik # 3. Flowcytometri
Trods betydningen af ​​de oplysninger, der fremkommer encellede målinger, er det vigtigt at analysere et stort antal celler for at undgå den fejlagtige ekstrapolation af celle-specifikke egenskaber til en hel population. Af denne grund er high-throughput teknikker begunstiges og den mest populære metode er flowcytometri, hvor 10.000 celler pr betingelse konventionelt analyseres. Denne metode giver mulighed multi-parametrisk analyse af heterogene populationer, da det kategoriserer celler efter deres størrelse (Forward Scatter (FSC)), granularitet (sidespredning (SSC)), og fluorescens-intensiteten (specifik mærkning med et antistof, levedygtighed markør etc.) , hvilket giver information om de parametre 'fordeling for en gruppe af celler. Flowcytometri giver øjeblikkelig snarere end tidsafhængig oplysninger ^8.. Frem og sidespredning værdier are også anvendelige til at vælge en port, der omfatter celler, men diskriminerer celleaffald, støv osv. For fluorescensmålinger, negative og positive fluorescens kontroller skal også medtages. Hvis mere end en fluorescens kanal anvendes, skal en proces kendt som kompensation udføres (for detaljer se http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Erstatning giver mulighed for spektrale overlap forskelsbehandling mellem fluoroforer. Flowcytometri tillader også diskrimination af døde celler, generelt ved hjælp af propidiumiodid-farvning.

Teknik # 4.. Single Cell Imaging
Mikroskopi er en anden almindelig metode til at studere enkelt celle adfærd og er velegnet til tidsafhængige undersøgelser og det giver også rumlig opløsning. En væsentlig ulempe er, at high-throughput analyse er kun i sin spæde begyndelse på nuværende tidspunkt <sup> 9.

Protocol

I denne artikel rapporterer vi brug af de fire ovennævnte teknikker til at måle [Ca2 +] i ændringer i humane sædceller. Vi brugte progesteron til at udløse en Ca 2 + svar, da det er veldokumenteret, at denne steroid producerer en transient [Ca 2 +] Jeg stige i spermatozoer. Især i human sæd, progesteron direkte aktiverer en Ca2 +-kanal (nemlig CatSper) udelukkende udtrykkes i plasmamembranen af sædceller 10,11. Vi har også målt hvile …

Representative Results

Figur 1. Skematisk diagram af forsøgsprotokollen for sæd prøveforberedelse ved swim-up-metoden. De vigtige skridt for adskillelse af bevægelige sædceller og justering af deres koncentration er illustreret. Det sidste inkuberingstrin kun udføres, når capacitation er påkrævet. <p class="jove_content" fo:keep-t…

Discussion

Intracellulær signalering er afgørende for de fleste cellulære aktiviteter Ca ^{2 +} er en allestedsnærværende budbringer, der ledsager pattedyrceller i hele deres levetid, fra deres oprindelse ved befrugtningen, til slutningen af deres livscyklus. Som reaktion på forskellige stimuli, [Ca ^{2 +]} Jeg stiger, svinger og afdrag med spatio-temporale kodificering, derfor er forskellige processer aktiveres, modulerede eller opsiges ved Ca ^{2 +-kodede} meddelelser. Intracellulær ^{Ca2 +</sup…}

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml