Mess-intrazellulären Ca^{2 +} Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Summary

Intrazelluläre Ca^{2 +} Dynamik sind sehr wichtig in Spermien Physiologie und Ca^{2 +} Fluoreszenzfarbstoffe bilden ein vielseitiges Werkzeug, um sie zu studieren. Bevölkerung Experimente (Fluorometrie und gestoppt Flußfluorometrie) und einzelne Zelle Experimente (Durchflusszytometrie und Single-Cell-Imaging) verwendet werden, um räumlich-zeitliche [Ca verfolgen^{2 +}] Veränderungen im menschlichen Spermien.

Abstract

Spermien sind männliche Keimzellen speziell entwickelt, um zu erreichen, zu erkennen und verschmelzen mit dem Ei. Um diese Aufgaben zu erfüllen, müssen Spermien bereit, eine sich ständig wandelnden Umfeld zu stellen und mehrere physische Barrieren überwunden werden. Sein Wesen in transkriptionell und translational still, verlassen sich diese bewegliche Zellen zutiefst auf verschiedenen Signal-Mechanismen, sich zu orientieren und schwimmen in einer gerichteten Weise und mit schwierigen Umgebungsbedingungen während ihrer Reise, um das Ei zu finden kämpfen. Insbesondere ist Ca ^{2 +-vermittelten} Signale entscheidend für mehrere Spermien Funktionen: Aktivierung der Motilität, capacitation (ein komplexer Prozess, die Spermien für die Akrosomreaktion bereitet) und der Akrosomreaktion (ein Ereignis, das exozytotische Spermien-Ei-Fusion ermöglicht). Der Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, um intrazelluläre Schwankungen dieses Ions zu verfolgen ist von bemerkenswerter Bedeutung aufgrund ihrer einfachen Anwendung, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit detection. Mit einem einzigen Farbstoff-loading-Protokoll nutzen wir vier verschiedene Techniken, um Spermien fluorometrische Ca ^{2 +} Dynamik überwachen. Jede Technik liefert verschiedene Informationen, die räumliche und / oder zeitliche Auflösung ermöglicht, die Erzeugung von Daten sowohl auf einzelne Zelle und Zellpopulation Ebenen.

Introduction

Ca ^{2 +} ist ein universelles second messenger von Signaltransduktionswegen in eukaryotischen Zellen. Intrazelluläre Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) ist an der Regulation vieler grundlegenden physiologischen Prozesse in beide erregbaren und nicht erregbaren Zellen. Die Bedeutung und die Universalität der Ca ^{2 +} als second messenger während Signaltransduktion von seiner räumlich-zeitlichen Vielseitigkeit bei der Übertragung von Informationen in der Zelle ab. Während Ca ^{2 +} nicht de novo oder abgebaut innerhalb der Zelle, dessen intrazelluläre Konzentration ^{([Ca2 +]} _i) synthetisiert werden soll, in sehr engen Grenzen durch unterschiedliche zelluläre Mechanismen, die kontinuierlich Puffer, absondern, zu unterteilen, und / beibehalten oder akkumulieren Ca ^{2 +.} Änderungen in der Konzentration dieses Ions in stark lokalisierten Bereichen innerhalb der Zelle ¹ auf, und die Entschlüsselung solcher Schwankungen ist wichtig für die Gewinnung eines deeper Verständnis von (1) ihre Rolle in der Signal-Mechanismus, (2) ihre physiologische Bedeutung, und (3) allgemeine Mechanismen der Zell-Signalisierung. Ca ^{2 +-vermittelte} Signalisierung von besonderer Bedeutung ist in Spermien Physiologie ^2. Beweglichkeit der Spermien ist eine der wichtigsten Funktionen für die Befruchtung erfolgreich, und in der Tat, mehrere Spermien-Motilität Defekte können Sterilität ^3-5 führen. Die Bedeutung von Ca ^{2 +} in Flagella Bewegung ist seit langem anerkannt ^6, jedoch ist der Mechanismus, wie Ca ^{2 +} steuert die spezifische Form Flagella Biegung ist nicht vollständig verstanden.

Vor der Fusion mit dem Ei, müssen Spermien durchlaufen capacitation, ein komplexer Prozess, abhängig von Spermien Wohnsitz innerhalb der weiblichen Trakt. Während capacitation werden die Spermien Membran Lipid Architektur und Organisation geändert, vor allem als Folge von Cholesterin Entnahme aus der Plasmamembran. Darüber hinaus sind mehrere Proteine ​​Tyrosin-Phosphorlierte ^7. Wichtig ist, dass während capacitation gibt es eine Zunahme des intrazellulären pH (pH _i) und von [Ca ^{2 +]} _i, und das Membranpotential hyperpolarisiert in einigen Arten ^2. Kapazitation erfolgt nur in einer Subpopulation von Spermien (20-40%), und die Mechanismen in all diesen zellulären Veränderungen beteiligt sind alles andere als klar. Es ist allgemein anerkannt, dass nur eine Subpopulation von kapazitierten Spermien die Akrosomreaktion (AR) zu unterziehen, wenn sie physiologische Induktoren ausgesetzt. Die AR ist auch ein Ca ^{2 +-regulierten} Ereignis für die Befruchtung in allen Arten besitzen ein Akrosom (spezialisierte Organellen mit äußeren und inneren Membranen) erforderlich. Dabei werden die äußeren akrosomalen Membran verschmilzt mit der Spermien Plasmamembran, Freisetzung hydrolytischer Enzyme, die die Samenzelle, die Glyco-Protein-Matrix um das Ei (zona pellucida oder ZP) eindringen können. Die AR macht auch eine neue fusogene Samenzelle Oberfläche, die mit interagiertdas Ei Plasmamembran für die endgültige Verschmelzung beider Keimzellen. Es gibt mehrere zelluläre Liganden darstellt, die AR, Progesteron eine der darunter untersucht induzieren.

In dieser Arbeit haben wir vier verschiedene Techniken, bei denen die Verwendung eines Ca ^{2 +-sensitiven} Fluoreszenzfarbstoff zu messen präsentieren [Ca ^{2 +]} _i Veränderungen in menschlichen Spermien durch Progesteron ausgelöst (außer für die Durchflusszytometrie, in denen wir messen die [Ca ^{2 +} ] _i erhöhen induziert während der in vitro Kapazitation-Prozess). In diesem speziellen Fall haben wir Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), ein membranpermeablen Farbstoff mit einem K _d = 325 nM. In vitro wir überwacht Fluoreszenz ändert sich als Funktion der Zeit mit drei der Methoden, und die vierte Technik wir gemessenen Fluoreszenz-Werte bei einem gegebenen Zeitpunkt. Diese unterschiedlichen Ansätze einander ergänzen, da sie insgesamt räumlicher und zeitlicher Auflösung liefernolution sowohl an der einzelnen Zelle und Zell-Population Ebenen.

Handy Bevölkerung oder Bulk-Experimente

Masse Techniken werden ausführlich nicht nur, weil die Instrumente, die sie benötigen leicht verfügbar sind, sondern auch, weil sie einfach, gut etabliert sind und damit für die Mittelung der Daten aus Messungen an Millionen von Zellen in einem einzigen Experiment durchgeführt werden.

Technik # 1. Konventionelle Fluorometrie
Diese Technik überwacht Änderungen in der Fluoreszenz als Funktion der Zeit; die Experimente in Glasküvetten mit Probenvolumina im Bereich von 200 bis 1000 ul durchgeführt. Das Mischen des zugegebenen Reagenzien erfordert Magnetrührstab und damit die zeitliche Auflösung erhalten wird, in der Größenordnung von Sekunden. Die typische Zelle Konzentrationsbereich der untersuchten Proben 10 ⁵ bis 10 ⁸ Zellen / ml.

Technik # 2. Gestoppt Flußfluorometrie
Tseine Technik überwacht auch Veränderungen in der Fluoreszenz als eine Funktion der Zeit, aber die Reagenzien schnell zusammen (durch Druck) in eine Aufnahme Küvette mit einem sehr kleinen Probenvolumen (im Bereich von 25 bis 100 ul) gemischt. Daher ist Homogenisierung Reagenzien unmittelbar, so dass eine hohe zeitliche Auflösung in der Größenordnung von Millisekunden. Analyse der resultierenden Fluoreszenz-Zeit-Spuren sind geeignet für die Bestimmung Reaktionsgeschwindigkeiten, die Aufklärung der Komplexität des Reaktionsmechanismus, Beschaffung von Informationen über kurzlebige Zwischenprodukte der Reaktion usw. Die gemeinsame Zelle Konzentrationsbereich der analysierten Proben ist 10 ⁵ -10 ⁷ Zellen / ml.

Single Cell Experimente

Masse Experimente den Durchschnittswert Verhalten einer großen Anzahl von Zellen, aber eine Population kann häufig eine heterogene einzustellen, die bei dieser Art von Messungen übersehen werden. Einzel-Zell-Techniken werden verwendet, um damit th ergänzene Informationen mit Zellpopulation Experimenten erhalten.

Technik # 3. Durchflusszytometrie
Trotz der Bedeutung der Informationen, die aus einzelnen Zellen Messungen ist es wichtig, eine große Anzahl von Zellen zu analysieren, um die fehlerhafte Extrapolation von Zell-spezifischen Eigenschaften auf eine gesamte Bevölkerung zu verhindern. Aus diesem Grund sind High-Throughput-Techniken begünstigt und die beliebteste Methode ist die Durchflusszytometrie, in denen 10.000 Zellen pro Zustand konventionell analysiert. Dieses Verfahren ermöglicht die multi-parametrische Analyse heterogener Bevölkerungen, wie es Zellen kategorisiert nach ihrer Größe (Vorwärtsstreuung (FSC)), Granularität (side scatter (SSC)) und die Fluoreszenzintensität (spezifische Markierung mit einem Antikörper, der Lebensfähigkeit Marker, etc.) , damit die Informationen über die Parameter 'verteilung für eine Gruppe von Zellen. Durchflusszytometrie bietet sofortigen anstatt zeitabhängige Informationen ^8. Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht Werte are auch hilfreich bei der Auswahl ein Tor, das Zellen enthält, aber unterscheidet Zelltrümmer, Staub usw. für Fluoreszenzmessungen, negative und positive Kontrollen Fluoreszenz ebenfalls aufzunehmen. Wenn mehr als ein Fluoreszenz-Kanal verwendet wird, muss ein Prozess als Entschädigung bekannt sind, durchgeführt (Details siehe werden http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Compensation ermöglicht spektrale Überlappung Diskriminierung unter Fluorophore. Durchflusszytometrie ermöglicht Diskriminierung von toten Zellen, im allgemeinen mittels Propidiumiodid-Färbung.

Technik # 4. Single Cell Imaging
Mikroskopie ist eine weitere häufige Methode, um einzelne Zelle Verhalten zu studieren, es ist gut für zeitabhängige Studien geeignet und es bietet auch die räumliche Auflösung. Ein großer Nachteil ist, dass High-Throughput-Analyse nur in den Kinderschuhen steckt in der heutigen Zeit <sbis> 9.

Protocol

In diesem Beitrag berichten wir über die Verwendung der vier oben genannten Techniken zu messen [Ca 2 +] i Veränderungen im menschlichen Spermien. Wir verwendeten Progesteron einen Ca 2 +-Antwort auslösen, wie es üblich ist, dass dieses Steroid einen transienten [Ca 2 +] i in Spermien erhöhen produziert. Insbesondere in menschlichen Spermien, Progesteron direkt aktiviert einen Ca 2 +-Kanals (nämlich CatSper) ausgedrückt ausschließlich in der Plasm…

Representative Results

Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Protokolls für die Spermien Probenvorbereitung von der Swim-up-Methode. Die wichtigsten Schritte für die Trennung der beweglichen Spermien und zur Anpassung ihrer Konzentration dargestellt. Der letzte Schritt der Inkubation wird nur durchgeführt, wenn capac…

Discussion

Intrazelluläre Signalwege ist von entscheidender Bedeutung für die meisten zellulären Aktivitäten; Ca ^{2 +} ist ein allgegenwärtiges Bote, Säugerzellen begleitet während ihrer gesamten Lebensdauer, von ihrem Ursprung bei der Befruchtung, bis zum Ende ihres Lebenszyklus. In Reaktion auf verschiedene Stimuli, [Ca ^{2 +]} i zunimmt, schwingt und nimmt mit raumzeitliche Codierung, dementsprechend, diverse Prozesse aktiviert, moduliert oder terminiert durch Ca ^{2 +-codierten} Nachrichten. Int…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml