細胞内Ca測定<sup> 2 +</sup4つの方法を使用して人間の精子で>変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング

Summary

細胞内Ca^{2 +}ダイナミクスは、精子生理学およびCaで非常に重要である^{2 +}感受性蛍光色素は、それらを研究するための多彩なツールを構成する。集団実験（蛍光法およびフロー蛍​​光停止）し、単一細胞実験（フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング）は、時空間の[Caを追跡するために使用され<sup> 2 +</supヒト精子細胞で>]変化。

Abstract

精子は、特に、到達認識し、卵と融合するように設計された男性の生殖細胞である。これらのタスクを実行するには、精子細胞は、絶えず変化する環境に直面して、いくつかの物理的な障壁を克服するために準備しなければなりません。転写と翻訳サイレント本質にある、これらの運動性の細胞は自分自身の向きに多様なシグナル伝達機構に深く依存しており、監督のファッションで泳ぎ、そして卵を見つけるために彼らの旅の間に環境条件に挑戦すると競合する。具体的には、Ca ^{2 +}の媒介シグナル伝達は、いくつかの精子の機能のための極めて重要です：運動の活性化能（先体反応のために精子を準備する複雑なプロセス）と、先体反応（精子卵の融合を可能にしますエキソサイトーシスイベント）。このイオンの細胞内変動を追跡するための蛍光色素の使用は、アプリケーション、感度の容易さのために顕著に重要である、とDETの汎用性ECTION。一つの染料ローディングプロトコルを用いて、我々は、精子のCa ^{2 +}動態を監視するために4つの異なる蛍光技術を利用。各手法は、シングルセル及び細胞集団レベルでデータを生成し、空間的および/または時間分解能を可能にする明確な情報を提供する。

Introduction

のCa ^{2 +は、}真核細胞内シグナル伝達経路の普遍的な二次メッセンジャーである。細胞内Ca ^{2 +（Ca 2 +}の_i）は興奮性と非興奮性細胞の両方で多くの基本的な生理的過程の調節に関与する。シグナル伝達事象中のセカンドメッセンジャーとしてのCa ²の重要性と普遍^+は、セル内の情報の伝送における時空間汎用性に由来する。のCa ^{2 +} のde novo又は細胞内で分解さ合成することはできないが、その細胞内濃度（[Ca ^{2 +]} _i）が連続的にバッファ、封鎖、区分化、および/ ​​またはカルシウム^2を蓄積するさまざまな細胞機構を介して非常に厳格な限度内に維持される^+。このイオンの濃度の変化は、セル¹内に高度にローカライズされた地域で発生し、このような変動を解読すると、デを得るために不可欠であることができますEPERのシグナル伝達機構（1）の役割を理解すること、（2）それらの生理的重要性、および細胞シグナル伝達の（3）一般的なメカニズム。のCa ^{2 +}を介するシグナル伝達は、精子生理学²において特に重要である。精子の運動性は、受精の成功のための最も重要な機能の一つであり、実際には、いくつかの精子の運動性の欠陥は不妊^3-5を引き起こす可能性があります。のCa ²の重要性⁺鞭毛運動には長い間^、6を認識されてきたが、どのようにのCa ²メカニズムは⁺鞭毛曲げ特定の形が完全に理解されていない制御します。

卵と融合する前に、精子は能、雌の管の内部の精子の住居に依存する複雑なプロセスを経る必要があります。能中、精子膜の脂質アーキテクチャおよび組織は、主に形質膜からコレステロール除去の結果として、変更される。さらに、いくつかのタンパク質はチロシン蛍光体であるylated ^7。重要なことは、受精能の間に細胞内のpHの上昇液_（i）との[Ca ^{2 +]} _iの 、膜電位はいくつかの種^に含ま過分極でもある。能では、精子の集団（20〜40％）で行われのみ、そして、これらすべての細胞の変化に関与するメカニズムは、はるかに明確にしています。これは、一般的に生理的なインダクタにさらされたときに受精能の唯一の集団は先体反応（AR）を受けることが認められている。 ARはまた、（外側と内側の膜と特殊なオルガネラ）先体を所有しているすべての種で受精に必要なCa ^{2 +}の調節イベントです。このプロセス中に精子の形質膜と外側の先体膜ヒューズは、精子細胞は、卵（透明帯、またはZP）を取り囲む糖タンパク質性マトリックスに浸透できるようにする加水分解酵素を放出する。また、ARと相互作用する新規融合精子の細胞表面を露出させる両方の配偶子の最終的な融合のための卵形質膜。 AR、ほとんどのそれらの間研究の一つであるプロゲステロンを誘発するいくつかの細胞リガンドがあります。

本研究で我々は〔Ca ^2を測定するフローサイトメトリーを除いてプロゲステロン（によって引き起こされるヒト精子での[Ca ^{2 +]} _iの変化を測定するためのCa ^{2 +}感受性蛍光色素の使用を含む四つの異なる手法を提示⁺ ] _i）が 体外受精能プロセスの間に誘導増加。この特定のケースで我々はフルオ-3のAM（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY）、K _D = 325 nMのと膜透過性染料を使用していましたin vitroでは 、我々は、方法論の3との時間の関数としての蛍光の変化をモニターしたそして第四の技術で我々は時間の単一の特定の時点での蛍光値を測定した。完全にそれらが空間的および時間的解像度を提供するので、これらの異なるアプローチは、互いに補完単一細胞及び細胞集団の両方のレベルでolution。

細胞集団またはバルク実験

彼らは十分に確立され、シンプルであり、単一の実験で細胞の数百万人上で実行される測定からの情報の平均化を可能にするので、彼らが必要とする楽器でも容易に入手可能であるが、あるため、バルクの技術が広範囲にだけ使用されています。

テクニック＃1。従来の蛍光測定
この技術は、時間の関数としての蛍光の変化を監視し、実験は、200〜1,000μlに至るまでサンプル量を有するガラスキュベットで行われる。追加された試薬の適切な混合は、磁気攪拌を必要とし、従って、得られた時間分解能は秒のオーダーである。分析されたサンプルの典型的な細胞濃度範囲は、10 ^{5〜10 8}細胞/ mlである。

テクニック＃2。停止フロー蛍光測定
Tその手法は、時間の関数としての蛍光の変化を監視したが、試薬が急速に非常に少量のサンプルボリューム（25-100μlの範囲）を含有する記録キュベットに（圧力を使用して）一緒に混合する。したがって、試薬の均質化は、ミリ秒のオーダーで高い時間分解能を可能に瞬間的である。得られた蛍光対時間トレースの分析は、分析試料の一般的な細胞濃度の範囲は短命反応中間体等に関する情報を取得し、反応機構の複雑さを解明、反応速度を決定するのに適している10 ^{5〜10 7}細胞/ ml。

単一細胞実験

バルク実験は、多数のセルの平均的挙動を報告しているが、人口が頻繁に測定のようなタイプの中に見過ごされている異種の性質を示すことができる。単一セル技術は、このように目を補完するために使用される電子情報は、細胞集団実験で得られた。

テクニック＃3。フローサイトメトリー
単一セル測定に起因する情報の重要性にもかかわらず、全人口のセル固有のプロパティの誤外挿を防止するために多数のセルを分析することが重要である。このため、高スループット技術が好まれている、最も一般的な方法は、条件あたり10,000細胞は、従来、分析された、フローサイトメトリーである。それは彼らの大きさ（前方散乱（FSC））、粒度（側方散乱（SSC））と蛍光強度（抗体との特異的標識、生存マーカーなど）に応じて細胞を分類し、この方法では、異種の個体群のマルチパラメトリック分析を可能に、したがって、セルのグループのパラメータ '分布に関する情報を提供する。フローサイトメトリーは、インスタントではなく、時間に依存した情報^を提供しています^8。前方と側方散乱値AR細胞が含まれていますが、蛍光測定、負と正の蛍光コントロールの細胞破片、ほこりなどを判別ゲートを選択するためにも有用電子も含まれている必要があります。複数の蛍光チャネルが使用される場合、補償として知られている処理（詳細は参照のために実行しなければならないhttp://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jspを ）。補償は、フルオロフォア間のスペクトルの重なり弁別が可能になります。フローサイトメトリーはまた、ヨウ化プロピジウム染色によって一般的に、死細胞の識別を可能にする。

技術＃4。単一細胞イメージング
顕微鏡法は、単一の細胞の挙動を研究するための別の一般的な方法であり、それは十分に時間依存性の研究に適しており、それはまた、空間分解能を提供する。主な欠点は、ハイスループット分析は現時点ではまだ揺籃期に唯一であるということです<s9>まで。

Protocol

本稿では、ヒトの精子細胞での[Ca 2 +] iの変化を測定するための4つの前述の技術の使用を報告している。それはよく、このステロイドは、一時の[Ca 2 +] iは精子の増加を生成することを確立されているように我々は、Ca 2 +の反応を誘発するためにプロゲステロンを使用していました。特に、ヒト精子において、プロゲステロンが直接精子細胞10,11</sup…

Representative Results

図1。スイムアップ法による精子サンプル調製のための実験プロトコールの概略図。精子の分離およびそれらの濃度を調整するための主要なステップが示されている。能が必要とされるときに最後インキュベーション工程にのみ実行される。 </…

Discussion

細胞内シグナル伝達は、ほとんどの細胞の活動のために不可欠であり、Ca ^{2 +}の受精で、その起源から、そのライフサイクルの終わりに、彼らの全体の寿命を通して、哺乳動物細胞に伴うユビキタスメッセンジャーです。別の刺激に応答して、[のCa ^{2 +]} iの増加、発振と時空成文とともに減少、それに応じて、多様なプロセスが起動され、変調された又はCa ^{2 +}でエンコー…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml