Mätning intracellulär Ca^{2 +} Förändringar i mänskliga spermier med fyra tekniker: Konventionell fluorometri Stoppad Flow fluorometri, flödescytometri och Single Cell Imaging

Summary

Intracellulär Ca^{2 +} Dynamik är mycket viktiga i sperma fysiologi och Ca^{2 +}-Känsliga fluorescerande färgämnen utgör ett mångsidigt verktyg för att studera dem. Befolkning experiment (fluorometri och stoppade flödet fluorometri) och enstaka experiment cell (flödescytometri och enda cell imaging) används för att spåra tid och rum [Ca^{2 +}] Förändringar i humana spermier.

Abstract

Spermier är manliga könsceller speciellt utformade för att nå, erkänna och smälta samman med ägget. För att utföra dessa uppgifter, måste sädesceller vara beredd att möta en ständigt föränderlig miljö och att övervinna flera fysiska hinder. Att vara i huvudsak transkriptionellt och translationellt tyst, dessa rörliga celler förlitar djupt på olika signaleringsmekanismer att orientera sig och simma i en riktad mode, och att brottas med tuffa miljöförhållanden under sin resa för att hitta ägget. I synnerhet är ^{Ca2 +-förmedlad} signalering avgörande för flera spermier funktioner: aktivering av motilitet, capacitation (en komplex process som förbereder sperma för akrosomreaktionen) och akrosomreaktionen (en exocytotic händelse som gör att sperma-ägg smältning). Användningen av fluorescerande färger för att spåra intracellulära fluktuationer i denna jon är av anmärkningsvärd betydelse på grund av deras enkla ansökan, känslighet och mångsidighet DETektion. Använda en enda färg-lastning protokoll vi använder fyra olika fluorometriska tekniker för att övervaka sperm ^{Ca2 +} dynamik. Varje teknik ger tydlig information som gör det möjligt för rumslig och / eller temporal upplösning, generera data både vid enstaka cell och cellnivåer befolkning.

Introduction

^{Ca2 +} är en universell andra budbärare av signaltransduktionsvägar i eukaryota celler. Intracellulära ^{Ca2 +} (Ca ^{2 +} _i) deltar i regleringen av många grundläggande fysiologiska processer i både hetsiga och icke-retbara celler. Vikten och universalitet ^{Ca2 +} som andra budbärare under signaltransduktionshändelser härrör från dess tid och rum mångsidighet i överföringen av uppgifter i cellen. Medan ^{Ca2 +} kan inte syntetiseras de novo eller degraderas i cellen, dess intracellulära koncentrationen ^{([Ca2 +]} _i) hålls inom mycket snäva gränser genom olika cellulära mekanismer som kontinuerligt buffert, sequester, kategoriserar, och / eller ackumuleras Ca ^{2 +.} Förändringar i koncentrationen av denna jon kan förekomma i mycket lokaliserade områden inom cellen ^1, och dechiffrera sådana svängningar är nödvändig för att få en deEPER förståelse av (1) deras roll i den signalerande mekanismen, (2) deras fysiologiska betydelse, och (3) allmänna mekanismer för cellsignalering. ^{Ca2 +-medierad} signalering är av särskild betydelse i sperma fysiologi ^2. Spermiemotilitet är en av de viktigaste funktionerna för gödsling framgång, och i själva verket kan flera spermiernas rörlighet defekter orsaka sterilitet ^3-5. Vikten av Ca ^{2 +} i flagellar rörelse har länge insett ^6, men det är mekanismen för hur Ca ^{2 +} styr den särskilda formen av flagellära böjning inte helt klarlagda.

Innan sammansmältning med ägget, måste spermierna genomgå capacitation, en komplex process som är avhängig spermier bostad innanför kvinnliga tarmkanalen. Under capacitation, är spermierna membranets lipid arkitektur och organisation ändras, främst som ett resultat av kolesterol avlägsnas från plasmamembranet. Dessutom flera proteiner är tyrosin-fosforylated ^7. Viktigt under capacitation finns det en ökning av intracellulärt pH (pH _i) och i [Ca ^{2 +]} _i, och membranpotentialen hyperpolariserar hos vissa arter ^2. Capacitation sker enbart i en delpopulation av spermier (20-40%), och de mekanismer som är involverade i alla dessa cellförändringar är långt ifrån klart. Det är allmänt accepterat att endast en subpopulation av capacitated spermier genomgå akrosomreaktionen (AR) när den utsätts för fysiologiska induktorer. AR är också en ^{Ca2 +-reglerade} omständigheter behövs för befruktning i alla arter som har en Akrosomen (specialiserad organell med yttre och inre membran). Under denna process de yttre akrosomala membranet säkringar med spermiens plasmamembranet, släppa hydrolytiska enzymer som tillåter spermie att penetrera Glyco-proteinartade matrisen som omger ägget (zona pellucida, eller ZP). AR exponerar också en ny fusogen yta spermie som interagerar medägget plasmamembranet för den slutliga fusionen av båda gameter. Det finns flera cellulära ligander som inducerar AR, progesteron är en av de mest studerade bland dem.

I detta arbete presenterar vi fyra olika tekniker som innefattar användning av en Ca ^{2 +-känsliga} fluorescerande färg för att mäta [Ca ^{2 +]} _i förändringar i mänskliga spermier utlöses av progesteron (med undantag för flödescytometri, där vi mätte [Ca ^{2 +} ] _Jag ökar induceras vid in vitro capacitation process). I detta fall använde vi Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), ett membran-genomsläppligt färgämne med ett _Kd = 325 nM. In vitro vi övervakas fluorescens ändras som en funktion av tiden med tre av de metoder, och med den fjärde tekniken mätte vi fluorescensvärden vid en enda given tidpunkt. Dessa olika synsätt kompletterar varandra, eftersom sammanlagt ger de rumsliga och tidsmässiga resolution på både enskild cell och cellnivåer befolkning.

Cell Befolkning eller Bulk Experiment

Bulk tekniker används flitigt inte bara för att de instrument de behöver är lätt tillgängliga, men också för att de är enkla, väl etablerade, och möjliggöra utjämning av information från mätningar utförda på miljontals celler i ett enda experiment.

Teknik # 1. Konventionell fluorometri
Denna teknik övervakar förändringar i fluorescens som en funktion av tid, de försöken utförs i glas Kyvett med provvolymer som sträcker sig från 200 till 1000 | il. Korrekt blandning av tillsatta reagens kräver magnetisk omröring, och därför den temporala upplösningen som erhålls är i storleksordningen sekunder. Den typiska cellkoncentrationen utbud av de analyserade proverna är 10 ⁵ -10 ⁸ celler / ml.

Teknik # 2. Stoppad Flow fluorometri
Thans teknik övervakar också förändringar i fluorescens som en funktion av tiden, men reagensen snabbt blandas (med tryck) i en inspelning kyvett innehållande en mycket liten provvolym (allt från 25 till 100 l). Därför är homogenisering av reagenser momentana, vilket möjliggör en hög temporal upplösning i storleksordningen millisekunder. Analys av de resulterande fluorescens mot tid spår är lämpliga för att bestämma reaktionshastigheter, belysa komplexiteten i reaktionsmekanismen, erhålla information om kortlivade reaktionsmellanprodukter, etc. Den gemensamma cellkoncentrationen sortiment av de analyserade proverna är 10 ⁵ -10 ⁷ celler / ml.

Single Cell Experiment

Bulk experiment rapporterar genomsnittliga beteendet hos ett stort antal celler, dock kan en population ofta uppvisar heterogena egenskaper som förbises vid denna typ av mätningar. Encelliga tekniker används således för att komplettera the information som erhållits med experiment cellpopulation.

Teknik # 3. Flödescytometri
Trots betydelsen av den information som härrör från en enda cell mätningar är det viktigt att analysera ett stort antal celler för att förhindra den felaktiga extrapolering av cell-specifika egenskaper till en hel population. Av detta skäl är hög genomströmning tekniker gynnat och den mest populära metoden är flödescytometri, där 10.000 celler per betingelse konventionellt analyseras. Denna metod gör multi-parametrisk analys av heterogena populationer som det kategoriserar celler enligt deras storlek (ljusspridning framåt (FSC)), granularitet (sidospridning (SSC)) och fluorescensintensitet (specifik märkning med en antikropp, viabilitet markör etc.) , vilket ger information om de parametrar "fördelning för en grupp av celler. Flödescytometri ger omedelbar stället tidsberoende uppgifter ^8. Framåt och side scatter värden ARe också användbart för att välja en grind som innehåller celler, men diskriminerar cellulärt skräp, damm, etc. För fluorescensmätningar, negativa och positiva fluorescens kontroller ska också ingå. Om mer än en fluorescens kanal används, måste en process som kallas kompensation utföras (för detaljer se http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Ersättning tillåter spektral överlappning diskriminering bland fluoroforer. Flödescytometri tillåter också diskriminering av döda celler, i allmänhet med hjälp av propidiumjodidfärgning.

Technique # 4. Single Cell Imaging
Mikroskopi är en annan vanlig metod för att studera enda cell beteende, det är väl lämpad för tidsberoende studier och det ger också rumslig upplösning. En stor nackdel är att hög genomströmning analys är endast i sin linda i dagsläget <sup> 9.

Protocol

I denna artikel rapporterar användningen av de fyra ovan nämnda tekniker för att mäta [Ca 2 +] i förändringar i humana spermier. Vi använde progesteron för att utlösa en Ca 2 + svar, eftersom det är väl känt att denna steroid producerar en övergående [Ca2 +] Jag ökar i spermier. I synnerhet, i mänskliga spermier, aktiverar progesteron direkt en Ca 2 +-kanal (nämligen CatSper) uttrycks uteslutande i plasmamembranet hos spermier 10,11….

Representative Results

Figur 1. Skiss av det experimentella protokollet för spermier provberedning av uppsimningsförfarandet. De viktigaste stegen för separation av rörliga spermier och för anpassning av deras koncentration illustreras. Den sista inkubationssteg utförs endast när capacitation krävs. <p class="jove_content" fo:keep-…

Discussion

Intracellulär signalering är avgörande för de flesta cellulära aktiviteter, ^{Ca2 +} är en allestädes närvarande budbärare som åtföljer däggdjursceller under hela deras livscykel, från sitt ursprung vid befruktningen till slutet av sin livscykel. Som svar på olika stimuli, ^{[Ca2 +]} i ökar, oscillerar och minskar med tid och rum kodifiering, följaktligen, är olika processer aktiveras, modulerade eller avslutas av ^{Ca2 +-kodade} meddelanden. Intracellulär Ca ^{2 +} dyna…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml