Recombineering homologe recombinatie in Constructen<em> Drosophila</em
Summary
Homologe recombinatie technieken sterk vooruit<em> Drosophila</em> Genetica doordat de vorming van moleculair precieze mutaties. De recente goedkeuring van recombineering maakt het mogelijk om grote stukken DNA te manipuleren en transformeren ze in<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. De methoden die hier gepresenteerde combineren van deze technieken om snel te genereren grote vectoren voor homologe recombinatie.
Abstract
De verdere ontwikkeling van technieken voor snelle, grootschalige manipulatie van endogene gen loci zal het gebruik van Drosophila melanogaster als een genetisch modelorganisme voor de menselijke-en vaatziekten gerelateerd onderzoek te verbreden. De afgelopen jaren hebben gezien de technische vooruitgang, zoals homologe recombinatie en recombineering. Echter, het genereren van eenduidige nulmutaties of tagging endogene eiwitten blijft een aanzienlijke inspanning voor de meeste genen. We beschrijven hier en demonstreren technieken voor het gebruik recombineering gebaseerde cloneringsmethoden vectoren die kunnen worden gebruikt om te richten en te manipuleren endogene loci in vivo genereren bijzonder hebben we een combinatie van drie technologieën vastgesteld:. (1) BAC transgenese / recombineering, ( 2) uiteinden-out homologe recombinatie en (3) Gateway-technologie om een robuuste, efficiënte en flexibele methode voor het manipuleren van endogene genomische loci bieden. In dit protocol, bieden we stap-voor-stap informatie over hoe u (1) ontwerp individuatiel vectoren, (2) hoe grote fragmenten van genomisch DNA te klonen in de homologe recombinatie vector behulp kloof reparatie, en (3) hoe de genen van belang vervangen of taggen binnen deze vectoren met behulp van een tweede ronde van recombineering. Ten slotte zullen we ook een protocol voor hoe je deze cassettes te mobiliseren in vivo naar een knock-out, of een tag gen via knock-in te genereren. Deze methoden kunnen eenvoudig worden vastgesteld voor meerdere doelen in parallel en vormen een middel voor het manipuleren van de Drosophila genoom op een tijdige en efficiënte manier.
Introduction
Reinig moleculair-gedefinieerde manipulaties van enkele genen op hun endogene loci bieden een waardevol instrument om een groot aantal vragen aan eukaryote biologie relevante bestuderen. Drosophila reverse genetische technieken voor het genereren van het verlies-van-functie allelen had bewezen een uitdaging tot Golic en collega geïntroduceerd in vivo gene targeting middels homologe recombinatie Drosophila 1-3. Zij toonden aan dat specifieke genomische loci kunnen worden gericht met behulp van een lineair fragment van DNA uit een geïntegreerde transgene construct. Deze lineaire "donor" DNA in vivo gegenereerd door FRT-bemiddelde recombinatie (voor het uitsnijden van het DNA van het chromosoom als een circulair molecuul) gevolgd door linearisatie van het meganuclease I-SCEI. Hoewel deze methode is met succes gebruikt om een verscheidenheid van gedefinieerde laesies genereren, is de techniek niet gemakkelijk schaalbaar is voor het manipuleren van vele genen in parallel omdat elke individueledubbele knockout construct vereist verschillende en aangepaste ontwerp. Zo zijn er problemen naadloos manipuleren van grote stukken DNA (> 5 kb) in vitro met klassieke restriction enzyme / ligatie klonen of PCR, en de grootte beperkingen van traditionele in vivo transformatievectoren vaak belemmeren dat spoedig homologe recombinatie richten vectoren. Om deze beperkingen te overwinnen, combineerden we de recombineering / transgenese P [Acman] systeem, dat de sub-klonen en transgenese van het mogelijk maakt tot 100 kb van DNA, met de uiteinden-out gentargeting methodologie om een efficiënt en relatief snelle platform dat vergemakkelijkt Drosophila gene targeting.
Recombinatie-gemedieerde genetische manipulatie (recombineering) is een krachtige homologe recombinatie gebaseerde klonen technologie 4,5. In tegenstelling tot conventionele restrictie-enzym / ligase klonen is recombineering niet beperkt door de sequentie of Size van de gemanipuleerde DNA. Recombineering gebruikt een speciale E. coli-stam die recombinatie machines geleverd door een defecte λ profaag 4 havens. Deze techniek is onlangs goedgekeurd voor toepassing in Drosophila 6,7. Recombineering in Drosophila is gebaseerd op een gemodificeerde voorwaardelijk amplificeerbaar bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) vector genaamd P [Acman] 6,7. Deze vector draagt twee oorsprongen van replicatie: OriV die hoog kopieaantal produceert op chemische inductie voor de zuivering van grote hoeveelheden DNA nodig voor sequencing en embryo injectie en ORIS, die onder basale omstandigheden low-copy number handhaaft. Bovendien, de P [Acman] vector is voorzien van een aanhechting van bacteriën (attB) plaats. De attB site als een substraat voor ΦC31 integrase gemedieerde transgenese is opname van grote DNA-fragmenten kunnen in een vooraf bepaalde landingsplaats in de Drosophila genoom 8,9.
We hebben gegenereerd een P [Acman] vector (aangeduid als P [Acman]-KO 1.0) die kunnen worden gebruikt als richtende vector voor ends-out homologe recombinatie 10,11. Op te nemen uiteinden-out gen targeting technologie in het systeem, voegden we twee FRT en twee I-SCEI sites. We hebben ook een Gateway cassette in deze vector gewijzigd om het proces van het opnemen van de homologie-armen in P [Acman]-KO 1.0 stroomlijnen. Dit geeft een snelle en eenvoudige manier om vrijwel elke genoomgebied plaats te introduceren in de targeting vector. In dit protocol beschrijven we hoe u een targeting vector met P [Acman]-KO 1.0, en hoe u deze vector mobiliseren in vivo aan de endogene locus richten ingenieur. Voor de toepassing van dit protocol zullen we de RFP / Kan cassette gebruiken om een gen van belang vervangt, maar een verscheidenheid van cassettes die een antibioticum selectiemerker bevatten kunnen worden gebruikt met dit protocol. We hebben ontworpen en met succes een reeks cassettesgenvervanging en tagging 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kracht van genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek is grotendeels gebaseerd op de tools beschikbaar voor genetische manipulatie. De kleine modellen C. elegans en Drosophila in het bijzonder zorgen voor goedkope en snelle moleculair genetische analyses van complete trajecten en gen families betrokken bij meercellige ontwikkeling of functie. De afgelopen jaren hebben significante vooruitgang in de ontwikkeling hulpmiddel gezien voor het manipuleren van genen in Drosophila 14,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Hugo Bellen en de Bloomington Stock Centrum voor reagentia. We verdere danken Koen Venken, Hugo Bellen en alle leden van de Buszczak en Hiesinger labs voor behulpzaam discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Health om ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) en MB (RO1GM086647), een subsidie van de Cancer Prevention Research Institute van Texas naar MB en PRH (RP100516) en de Welch Foundation (I-1657) te PRH. MB is een EE en Greer Garson Fogelson Scholar in biomedisch onderzoek en PRH is een Eugene McDermott Scholar in biomedisch onderzoek aan de UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. 유전학. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. 유전학. 166, 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
- Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
- Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
- Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
- Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
