Recombineering homologues constructions de recombinaison<em> Drosophila</em
Summary
Techniques de recombinaison homologue progresser considérablement<em> Drosophila</em> Génétique en permettant la création de mutations moléculaires précises. L'adoption récente de recombineering permet de manipuler de gros morceaux de l'ADN et les transformer en<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. Les méthodes présentées ici combiner ces techniques afin de générer rapidement de grands vecteurs de recombinaison homologue.
Abstract
La poursuite du développement des techniques de manipulation rapide et à grande échelle des loci des gènes endogènes permettra d'élargir l'utilisation de Drosophila melanogaster comme un organisme modèle génétique pour la recherche liée à la maladie humaine. Ces dernières années ont vu des progrès techniques comme la recombinaison homologue et recombineering. Cependant, générant des mutations nulles équivoques ou des protéines endogènes de marquage reste un effort substantiel pour la plupart des gènes. Ici, nous décrivons et démontrer les techniques pour l'utilisation de méthodes de clonage recombineering basés à générer des vecteurs qui peuvent être utilisés pour cibler et manipuler des loci endogènes in vivo Plus précisément, nous avons mis en place une combinaison de trois technologies:. (1) BAC transgénèse / recombineering, ( 2) extrémités-out recombinaison homologue et (3) la technologie de passerelle de fournir une méthode robuste, efficace et flexible pour manipuler des loci génomiques endogènes. Dans ce protocole, nous fournissons des détails étape par étape sur la façon de (1) la conception individuaL vecteurs, (2) comment cloner de grands fragments d'ADN génomique dans le vecteur de recombinaison homologue en utilisant gap repair, et (3) comment remplacer ou étiqueter les gènes d'intérêt au sein de ces vecteurs à l'aide d'un second tour de recombineering. Enfin, nous allons également fournir un protocole pour savoir comment mobiliser ces cassettes in vivo pour produire un knock-out ou un gène marqué par knock-in. Ces méthodes peuvent facilement être adoptées pour plusieurs cibles en parallèle et fournissent un moyen pour manipuler le génome de la drosophile dans une manière opportune et efficace.
Introduction
Nettoyez manipulations moléculaires définis de gènes uniques à leurs loci endogènes offrent un outil précieux pour étudier une multitude de questions pertinentes à la biologie eucaryote. Drosophila inverser techniques génétiques pour générer des allèles de perte de fonction s'était avéré être difficile jusqu'à ce que Golic et ses collègues ont introduit dans génique in vivo en utilisant le ciblage recombinaison homologue chez la drosophile 1-3. Ils ont démontré que loci génomiques spécifiques pourraient être ciblés en utilisant un fragment linéaire d'ADN à partir d'une construction transgénique intégré. Cet ADN «donneur» linéaire est généré in vivo par recombinaison FRT à médiation (pour exciser l'ADN du chromosome en une molécule circulaire) puis linéarisation avec la méganucléase I-Scel. Bien que cette méthode a été utilisée avec succès pour produire une variété de lésions définies, la technique n'a pas été facilement évolutive pour la manipulation de nombreux gènes en parallèle car chaque indiviconstruction double KO nécessite une conception distincte et personnalisée. Par exemple, des difficultés à manipuler de façon transparente grands fragments d'ADN (> 5 ko) in vitro en utilisant l'enzyme classique de restriction / ligature clonage ou PCR, ainsi que les limitations de taille de traditionnel dans des vecteurs de transformation in vivo interfèrent souvent avec la création rapide d'une recombinaison homologue ciblage vecteurs. Pour surmonter ces limitations, nous avons combiné le système P [ACMAN] de recombineering / de transgénèse, qui permet au sous-clonage et la transgenèse jusqu'à 100 kb d'ADN, avec le gène extrémités-out méthodologie de ciblage d'établir une plate-forme efficace et relativement rapide que facilite le ciblage génique Drosophila.
Recombinaison induite par génie génétique (recombineering) est un puissant recombinaison homologue basé sur la technologie du clonage 4,5. Contrairement aux enzyme / ligase clonage de restriction conventionnelle, recombineering n'est pas limitée par la séquence ou Size de l'ADN manipulée. Recombineering utilise un E. spéciale coli souche qui abrite les machines de recombinaison fourni par un λ défectueux prophage 4. Cette technique a récemment été adopté pour une utilisation chez la drosophile 6,7. Recombineering chez la drosophile repose sur un chromosome modifié conditionnellement amplifiable artificiel bactérien (BAC) de vecteur appelé P [ACMAN] 6,7. Ce vecteur porte deux origines de réplication: oriV, qui produit nombre élevé de copies lors de l'induction chimique pour la purification de grandes quantités d'ADN nécessaires pour le séquençage et l'injection de l'embryon et Oris, qui maintient faible nombre de copies dans des conditions basales. En outre, le P [ACMAN] vecteur est équipé d'un site de fixation des bactéries (attB). Le site attB sert de substrat pour la transgenèse OC31 intégrase à médiation qui permet l'incorporation de grands fragments d'ADN dans un site d'atterrissage prédéterminée à l'intérieur du génome de la drosophile 8,9.
Nous avons généré un P [ACMAN] vecteur (dénommé P [ACMAN] KO 1.0) qui peut être utilisé comme un vecteur de ciblage à des fins départ recombinaison homologue 10,11. Pour intégrer extrémités-out ciblage génique technologie dans le système, nous avons ajouté deux deux sites I-Scel FRT et. Nous avons également inclus une cassette Gateway dans ce vecteur modifié pour simplifier le processus d'incorporation des bras d'homologie en P [ACMAN] KO 1.0. Cela fournit un moyen rapide et simple d'introduire pratiquement n'importe quelle région génomique d'intérêt dans le vecteur de ciblage. Dans ce protocole, nous allons décrire comment concevoir un vecteur de ciblage en utilisant P [ACMAN] KO 1.0, et comment mobiliser ce vecteur in vivo pour cibler le locus endogène. Aux fins du présent protocole, nous allons utiliser la cassette DDP / Kan pour remplacer un gène d'intérêt, mais une variété de cassettes qui contiennent un marqueur de sélection antibiotique peut être utilisé avec ce protocole. Nous avons conçu et utilisé avec succès une série de cassettes pourremplacement d'un gène et l'étiquetage 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
La puissance des organismes modèles génétiques dans la recherche biomédicale repose en grande partie sur les outils disponibles pour la manipulation génétique. Les petits modèles C. elegans et Drosophila en particulier permettre des analyses génétiques moléculaires peu coûteux et rapide des parcours complets et des familles de gènes impliqués dans le développement ou la fonction multicellulaire. Ces dernières années ont vu des avancées significatives dans le développement d'outils…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Hugo Bellen et l'Bloomington Stock Center for réactifs. Nous remercions encore Koen Venken, Hugo Bellen et tous les membres du laboratoire Buszczak et Hiesinger pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national de la santé de l'ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) et Mo (RO1GM086647), une subvention de l'Institut de recherche sur la prévention du cancer du Texas à Mo et PRH (RP100516), et le Welch Foundation (I-1657) à PRH. MB est un EE et Greer Garson Fogelson Scholar dans la recherche biomédicale et PRH est un McDermott Scholar Eugene dans la recherche biomédicale à l'UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
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