Recombineering costrutti omologhi ricombinazione<em> Drosophila</em
Summary
Tecniche di ricombinazione omologa notevolmente avanzare<em> Drosophila</em> Genetica, consentendo la creazione di mutazioni molecolarmente precise. La recente adozione del recombineering permette di manipolare grandi pezzi di DNA e di trasformarle in<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. I metodi qui presentati combinare queste tecniche per generare rapidamente grandi vettori di ricombinazione omologa.
Abstract
Il continuo sviluppo di tecniche per veloce, manipolazione su larga scala di endogeni loci genici estenderà l'uso di Drosophila melanogaster come organismo modello genetico per la ricerca connessa umano-patologia. Gli ultimi anni hanno visto progressi tecnici come ricombinazione omologa e recombineering. Tuttavia, generando null mutazioni inequivocabili o proteine endogene di tagging rimane un notevole sforzo per la maggior parte dei geni. Qui, descriviamo e dimostrare le tecniche per l'utilizzo di metodi di clonazione recombineering-based per generare vettori che possono essere utilizzati per indirizzare e manipolare loci endogeni in vivo In particolare, abbiamo stabilito una combinazione di tre tecnologie:. (1) BAC transgenesi / recombineering, ( 2) le estremità-out ricombinazione omologa e (3) la tecnologia Gateway per fornire un robusto metodo, efficiente e flessibile per manipolare loci genomici endogeni. In questo protocollo, noi forniamo i dettagli passo-passo su come (1) disegno individuavettori l, (2) come clonare grossi frammenti di DNA genomico nel vettore di ricombinazione omologa utilizzando riparazione gap, e (3) come sostituire o tag geni di interesse all'interno di questi vettori che utilizzano un secondo giro di recombineering. Infine, ci sarà anche fornire un protocollo per il modo di mobilitare queste cassette in vivo per generare un ko, o di un gene con tag via knock-in. Possono essere facilmente adottate Questi metodi per obiettivi multipli in parallelo e forniscono un mezzo per manipolare il genoma di Drosophila in modo tempestivo ed efficiente.
Introduction
Pulire manipolazioni molecolarmente definiti di singoli geni a loro loci endogene offrono uno strumento prezioso per lo studio di una miriade di domande pertinenti alla biologia degli eucarioti. Drosophila invertire tecniche genetiche per la generazione di alleli perdita-di-funzione avevano dimostrato di essere una sfida fino Golic e colleghi hanno introdotto in genica in vivo il targeting utilizzando la ricombinazione omologa di Drosophila 1-3. Hanno dimostrato che specifici loci genomici possono essere mirate utilizzando un frammento di DNA lineare da un costrutto transgenico integrato. Questo DNA lineare "donatore" viene generato in vivo mediante ricombinazione FRT-mediata (di asportare il DNA dal cromosoma come molecola circolare) seguita da linearizzazione con il meganuclease I-SCEI. Sebbene questa metodologia è stata utilizzata con successo per generare una varietà di lesioni definite, la tecnica non è facilmente scalabile per la manipolazione di numerosi geni in parallelo, poiché ciascun indivicostrutto doppio ko richiede design distinto e personalizzato. Per esempio, la difficoltà di manipolare grandi senza soluzione di frammenti di DNA (> 5 kb) in vitro usando enzimi di restrizione classica / legatura clonazione o PCR, nonché le limitazioni di dimensione dei tradizionali in vettori di trasformazione in vivo spesso interferiscono con la rapida realizzazione di ricombinazione omologa di targeting vettori. Per superare queste limitazioni, abbiamo unito il sistema P [acman] recombineering / transgenesi, che consente al sub-clonazione e transgenesi fino a 100 kb di DNA, con l'estremità-out gene targeting metodologia per stabilire una piattaforma efficiente e relativamente rapido che facilita gene Drosophila targeting.
Ricombinazione mediata da ingegneria genetica (recombineering) è un potente ricombinazione omologa a base di tecnologia di clonazione 4,5. In contrasto con l'enzima di restrizione convenzionale / ligasi clonazione, recombineering non è limitata dalla sequenza o size del DNA manipolato. Recombineering utilizza uno speciale E. coli ceppo che ospita macchinari ricombinazione fornito da un λ difettoso profago 4. Questa tecnica è stata recentemente adottata per l'utilizzo in Drosophila 6,7. Recombineering in Drosophila si basa su un condizionale amplificabile cromosoma artificiale batterico modificato (BAC) vettore chiamato P [acman] 6,7. Questo vettore porta due origini di replicazione: oppureiv, che produce numero elevato di copia dopo induzione chimica per la purificazione di grandi quantità di DNA necessarie per il sequenziamento e l'iniezione embrione e ORIS, che mantiene basso numero di copie in condizioni basali. Ulteriormente, il P [acman] vettore è dotato di un sito di attacco batterico (attB). Il sito attB serve come substrato per ΦC31 integrasi transgenesi mediata che permette l'incorporazione di grandi frammenti di DNA in un sito di atterraggio predeterminata all'interno del genoma di Drosophila 8,9.
Abbiamo generato un P [acman] vettore (denominato P [acman]-KO 1.0) che può essere utilizzato come vettore di targeting per fini-out ricombinazione omologa 10,11. Per incorporare le estremità-out dei geni della tecnologia nel sistema, abbiamo aggiunto due FRT e due siti di I-SCEI. Abbiamo incluso anche una cassetta Gateway all'interno di questo vettore modificata per semplificare il processo di integrazione tra le braccia di omologia in P [acman]-KO 1.0. Questo fornisce un modo rapido e semplice per introdurre virtualmente qualsiasi regione genomica di interesse nel vettore targeting. In questo protocollo si descrivono Come Engineer un vettore targeting utilizzando P [acman]-KO 1.0, e come mobilitare questo vettore in vivo di indirizzare il locus endogeno. Ai fini del presente protocollo useremo la cassetta RFP / Kan per sostituire un gene di interesse, ma una serie di cassette che contengono un marcatore di selezione antibiotico può essere utilizzato con questo protocollo. Abbiamo progettato e utilizzato con successo una serie di cassette persostituzione del gene e tagging 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il potere di organismi modello genetiche nella ricerca biomedica è largamente basato sugli strumenti disponibili per la manipolazione genetica. I piccoli modelli C. elegans e Drosophila consentire, in particolare economico e veloce molecolare le analisi genetiche dei percorsi completi e famiglie di geni implicati nello sviluppo o nella funzione multicellulare. Gli ultimi anni hanno visto progressi significativi nello sviluppo strumento per manipolare i geni in Drosophila 14,15. Per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Hugo Bellen e la Bloomington Stock Center per i reagenti. Ringraziamo inoltre Koen Venken, Hugo Bellen e tutti i membri del laboratorio Buszczak e Hiesinger per le discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institute of Health di ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) e MB (RO1GM086647), una sovvenzione dal Cancer Prevention Research Institute del Texas a MB e PRH (RP100516), e la Welch Fondazione (I-1657) a PRH. MB è un EE e Greer Garson Fogelson Scholar in Ricerca Biomedica e PRH è una Eugene McDermott Scholar in Ricerca Biomedica presso UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. 유전학. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. 유전학. 166, 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
- Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
- Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
- Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
- Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
