에서 상동 재조합 구문을 Recombineering<em> 초파리</em
Summary
상동 재조합 기술은 크게 발전<em> 초파리</em> 분자 정확한 돌연변이의 생성을 가능하게함으로써 유전학. recombineering의 최근 채용 한 DNA의 큰 조각을 조작으로 그들을 변환 할 수 있습니다<em> 초파리</em<sup> 6</sup>. 방법은 신속하게 대규모 상동 재조합 벡터를 생성하기 위해 이러한 기술을 결합하여 여기에 제시 하였다.
Abstract
내생 유전자 좌위의 빠르고 대규모 조작 기술의 지속적인 발전은 인간의 질병 관련 연구를위한 유전자 모델 생물로 초파리의 사용을 확대 할 것이다. 최근 몇 년 동안 상동 재조합 recombineering 같은 기술 발전을 볼 수있다. 그러나 명백한 널 돌연변이 또는 태그 내생 단백질을 생성하는 것은 대부분의 유전자 상당한 노력이 남아있다. 여기, 우리는 생체 내에서 내생 궤적을 대상으로하고 조작하는 데 사용할 수있는 벡터를 생성하는 recombineering 기반 복제 방법을 사용하는 방법을 설명하고 보여 구체적으로, 우리는 세 가지 기술의 조합을 설립했습니다. (1) BAC의 transgenesis / recombineering ( 2) 끝 아웃 상동 재조합 (3) 게이트웨이 기술은 내생 게놈 유전자 좌를 조작하기위한 강력하고 효율적이며 유연한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 방법 (1) 디자인 individua에 대한 단계별 세부 사항을 제공L 벡터, (2) 간격 수리 (3) 방법 recombineering의 두 번째 라운드를 사용하여 이러한 벡터에서 관심의 유전자를 바꾸거나 태그를 사용하여 상동 재조합 벡터로 게놈 DNA의 큰 조각을 복제하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 또한 녹아웃, 또는 노크의를 통해 태그 유전자를 생성하기 위해 생체 내에서 이러한 카세트를 동원하는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 쉽게 병렬로 여러 대상에 채택하고시의 적절하고 효율적인 방법으로 초파리의 게놈을 조작하기위한 수단을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
자신의 내생 유전자 좌에서 단일 유전자의 분자 정의 된 조작을 청소하는 진핵 세포 생물학 관련 질문 수많은 연구에 귀중한 도구를 제공합니다. 초파리는 기능 상실 대립 유전자를 생성하는 유전자 기법을 역 Golić 선수와 동료에 도입 될 때까지 도전 할 수 입증했다 생체 내 유전자는 초파리 1-3에 상동 재조합을 사용하여 대상. 그들은 특정 게놈 유전자 좌가 통합 된 형질 전환 구조에서 DNA의 선형 조각을 사용하여 대상이 될 수 있습니다 보여 주었다. 이 선형 "기증자"DNA는 meganuclease I-SCEI와 선형화 다음 FRT-매개 재조합 (소비세에 원형의 분자와 같은 염색체에서 DNA)를 통해 생체 내에서 생성됩니다. 이 방법이 성공적으로 정의 된 병변의 다양한 생성하는 데 사용되었습니다 있지만, 기술은 병렬로 다수의 유전자의 조작에 쉽게 확장되지 않았기 때문에 각 indivi이중 녹아웃 구조는 독특하고 사용자 정의 디자인을 필요로합니다. 예를 들어, 완벽하게 고전적인 제한 효소 / 결찰 복제 또는 PCR뿐만 아니라, 생체 내 변환 벡터 전통의 크기 제한을 사용하여 체외에서 DNA (> 5 개 KB)의 큰 조각을 조작하는데 어려움은 종종 대상 상동 재조합의 신속한 생성을 방해 벡터. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 끝 아웃 유전자가 효율적이고 비교적 빠른 플랫폼을 구축하는 방법론을 대상으로, DNA의 최대 100KB의 하위 복제 및 transgenesis 수 있습니다 recombineering / transgenesis P [acman] 시스템을 결합하는 초파리 유전자 타겟팅 용이하게합니다.
재조합 – 중재 유전 공학 (recombineering)는 4,5 강력한 상동 재조합 기반의 복제 기술입니다. 기존의 제한 효소 / 리가 복제 대조적으로, recombineering는 순서 나 SIZ에 의해 제한되지 않는다조작 된 DNA의 전자. Recombineering는 특별한 E.를 사용 결함 λ prophage 4에서 제공하는 재조합 기계를 품고 대장균 균주. 이 기술은 최근 초파리 6.7에서 사용하기 위해 채택되었다. 초파리에 Recombineering은 P [acman] 6,7이라고 수정 조건부 증폭 세균 인공 염색체 (BAC) 벡터에 의존합니다. OriV, 시퀀싱 및 배아 주입 기저 상태에서 낮은 사본 번호를 유지 오리스에 필요한 DNA의 대량의 정화를위한 화학 유도에 높은 사본 번호가 생성이 벡터는 두 가지 복제 기원을 수행합니다. 또한, P [acman] 벡터는 세균 첨부 (attB) 사이트가 장착되어 있습니다. attB 사이트는 초파리 게놈 8,9에서 소정의 방문 사이트에 큰 DNA 조각의 설립을 허용 ΦC31 integrase-매개 transgenesis위한 기판 역할을합니다.
우리는 끝 아웃 상동 재조합 10,11에 대한 대상 벡터로 사용할 수있는 P [acman] 벡터 (P [acman]-KO 1.0라고도 함) 생성 한. 시스템에 타겟팅 기술을 통합하는 끝을 밖으로 유전자, 우리는 2 FRT와 두 개의 I-SCEI 사이트를 추가했습니다. 우리는 또한 P [acman]-KO 1.0에 상동 팔을 통합하는 프로세스를 간소화하기 위해이 수정 된 벡터 내의 게이트웨이 카세트를 포함했다. 이 대상 벡터에 관심 거의 모든 게놈 영역을 소개하는 신속하고 간단한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜에서 우리는 P [acman]-KO 1.0 및 방법 내생 현장을 대상으로 생체 내에서이 벡터를 동원하는 방법을 사용하여 대상 벡터를 엔지니어링하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해 우리는 관심의 유전자를 대체하기 위해 RFP / 칸 카세트를 사용하지만 항생제 선택 마커를 포함하는 카세트의 다양한이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 우리는 카세트의 집합에 대한 설계하고 성공적으로 사용했습니다유전자 교체 및 태그 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
생물 의학 연구에서 유전자 모델 생물의 힘은 크게 유전 조작을 위해 사용할 수있는 도구를 기반으로합니다. 작은 모델 C. 특히 엘레과 초파리는 다세포 개발이나 기능에 연루 전체 경로와 유전자 가족의 저렴하고 빠른 분자 유전 학적 분석을 허용합니다. 최근 몇 년 동안 초파리 14,15의 유전자를 조작하기위한 도구 개발에 상당한 진전을 보았다. 예를 들어, 널리 혈중 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 휴고 Bellen 및 시약 블루밍턴 증권 센터 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 더 도움이 토론 공원 Venken, 휴고 Bellen 및 Buszczak 및 Hiesinger 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 ACR에 건강의 국립 연구소 (T32GM083831), PRH (RO1EY018884)에서 교부금에 의해와 MB (RO1GM086647), MB와 PRH (RP100516)에 텍사스의 암 예방 연구소 부여, 그리고 웰치에 대한 지원 PRH에 기초 (I-1657). MB는 생물 의학 연구 및 PRH에서 전자와 그리어 GARSON Fogelson 학술 것은 UT 남서 의료 센터에 생물 의학 연구에 유진 맥 더못 학자이다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
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