In vivo billeddannelse af tumorangiogenese hjælp Fluorescens Confocal Videomicroscopy
Summary
I dette papir, præsenterer vi en metode til at analysere tumor mikrokar in vivo ved hjælp af dynamisk kontrast-forstærkede fluorescens videomicroscopy. To kvantitative parametre blev erhvervet: funktionel kapillartæthed afspejler vaskularisering af tumoren, og indeks lækage afspejler utætheder af endotel væg.
Abstract
Fibered konfokal fluorescens in vivo billeddannelse med en fiberoptisk bundt anvender samme princip som fluorescerende konfokal mikroskopi. Det kan vække fluorescerende in situ elementer gennem de optiske fibre, og derefter optage nogle af de udsendte fotoner, via de samme optiske fibre. Lyskilden er en laser, der sender det exciterende lys gennem et element i fiberbundtet og som det scanner over prøven, genskaber et billede pixel for pixel. Da denne scanning er meget hurtigt, ved at kombinere det med dedikeret billedbehandling software, kan billeder i realtid med en frekvens på 12 billeder / sek opnås.
Vi har udviklet en teknik til kvantitativt karakterisere kapillær morfologi og funktion, ved hjælp af en konfokal fluorescens videomicroscopy enhed. Det første skridt i vores forsøg var at optage 5 sec film i de fire kvadranter af tumor for at visualisere det kapillære netværk. Alle film blev behandlet ved hjælp af software (jegmageCell, Mauna Kea Technology, Paris Frankrig), der udfører en automatiseret segmentering af skibe omkring en udvalgt diameter (10 um i vores tilfælde). Således kunne vi kvantificere »funktionel kapillartæthed", som er forholdet mellem det samlede skib areal og det samlede areal af billedet. Denne parameter var et surrogat markør for mikrovaskulære tæthed, som regel målt ved hjælp af patologi værktøjer.
Andet skridt var at optage film af tumoren over 20 minutter at kvantificere lækage af den makromolekylære kontraststof gennem kapillærvæggen ind interstitium. Ved at måle forholdet mellem signal intensitet i interstitium over det i skibene blev et 'indeks udsivning "opnået, som et surrogat markør for kapillarpermeabilitet.
Introduction
Angiogenese er en kompleks proces 1, som involverer dannelsen af nye blodkar fra præ-eksisterende fartøjer. Patologiske forandringer i væv mikrocirkulationen, der består af arterioler, kapillærer og venuler, er impliceret i en lang række sygdomme, såsom cancer, inflammation eller diabetes. Det er derfor vigtigt at udvikle metoder til kvantitativ vurdering mikrokardannelse struktur og funktion. Imaging muliggør studiet af mikrokar i en ikke-eller mikro-invasiv måde, i real-tid og in vivo, og gentagne målinger over tid i det samme dyr 2..
I øjeblikket er dynamisk kontrast-forstærket (DCE) billeddannelse 3 almindeligt anvendt til at vurdere væv mikrocirkulationen. Dynamisk kontrast-forstærkede billeddannelse er en teknik, som følger med tiden biofordelingen af et sporstof injiceres intravenøst. Fra denne overtagelse, kan kvantitative parametre udvindes reflekterende væv vaskularisering. DCE imaginghar været oftest bruges med CT, MR eller ultralyd. Men disse billeddiagnostiske teknikker ikke tillader direkte visning af mikrokar, da deres opløsning, andet end med brug af specifikke eksperimentelle enheder, oftest forbliver makroskopisk.
I dette papir, foreslår vi at studere tumorvaskulaturen på mikroskopisk skala og in vivo ved hjælp af dynamisk kontrast-forstærkede optisk billeddannelse, med fibered konfokal videomicroscopy. Vi brugte en makromolekylær kontraststof (FITC-dextran), som fortsat udelukkende inden for skibe eller utætheder gennem endotel barriere i interstitium ifølge sin molekylvægt og de særlige kendetegn ved endotel af vævet studerede 4.. Dette gav undersøgelse af både mikrokardannelse struktur, ved korrekt at afgrænse fartøjer, og kapillærpermeabilitet ved utætte og akkumulere i interstitium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet af tumor mikrocirkulationen er blevet vigtigt i forståelsen af patofysiologien af tumorvækst, formidling og respons på behandling 1. Optisk billeddannelse er en af de teknikker, der kan anvendes til at overholde de kapillærer under anvendelse af et fluorescerende kontrastmiddel og kvantificere morfologiske (Functional Kapillær Density) og funktionelle (indeks lækage) parametre.
Den fluorescens mikroskopi billeddannelse vi brugte i denne undersøgelse har både …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio – MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. . Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
