In vivo avbildning av tumor angiogenese med fluoresens Confocal Videomicroscopy

Summary

I denne artikkelen presenterer vi en metode for å analysere kreft microvessels in vivo ved hjelp av dynamisk kontrast forbedret fluorescens videomicroscopy. To kvantitative parametre ble kjøpt: funksjonell kapillærtetthet reflekterer vaskulariteten av svulsten, og indeksen lekkasje reflekterer leakiness av endothelial veggen.

Abstract

Fibered konfokal fluorescens in vivo imaging med en fiberoptisk bunt er det samme prinsippet som fluorescerende konfokal mikroskopi. Det kan eksitere fluorescerende in situ elementene gjennom de optiske fibre, og så ta opp noen av de utsendte fotoner, via de samme optiske fiber. Lyskilden er en laser som sender ekssitering av lys gjennom et element inne i fiberbunten, og som skanner over prøven, gjenskaper et bilde piksel for piksel. Som denne skanningen er veldig fort, ved å kombinere den med dedikert programvare for bildebehandling, kan bilder i sanntid med en frekvens på 12 bilder / sek oppnås.

Vi utviklet en teknikk for å kvantitativt karakter kapillær morfologi og funksjon, ved hjelp av en confocal fluorescens videomicroscopy enhet. Det første trinnet i eksperimentet vårt var å spille inn 5 sek filmer i de fire kvadrantene av svulsten for å visualisere kapillær nettverk. Alle filmene ble behandlet ved hjelp av programvare (jegmageCell, Mauna Kea Technology, Paris Frankrike) som utfører en automatisk segmentering av fartøyer rundt en valgt diameter (10 mikrometer i vårt tilfelle). Dermed kan vi kvantifisere "funksjonelle kapillære tetthet", som er forholdet mellom det totale fartøy området og det totale areal av bildet. Denne parameteren var en surrogatmarkør for mikrovaskulær tetthet, vanligvis målt ved hjelp av patologi verktøy.

Det andre trinn var å ta opp film av svulsten løpet av 20 min for å kvantifisere lekkasje av det makromolekylære kontrastmiddel gjennom kapillære vegg inn i interstitium. Ved å måle forholdet mellom signalintensitet i interstitium over det i skipene, ble en 'index lekkasje' innhentet, fungerer som en surrogatmarkør for kapillær permeabilitet.

Introduction

Angiogenese er en kompleks prosess som involverer ^en dannelse av nye blodkar fra pre-eksisterende fartøyer. Patologiske endringer i mikrosirkulasjon vev, bestående av arterioler, kapillærer og venules, er innblandet i et stort utvalg av sykdommer så som kreft, inflammasjon, eller diabetes. Det er derfor viktig å utvikle metoder for å kvantitativt vurdere microvessel struktur og funksjon. Imaging muliggjør studium av microvessels i et ikke-eller mikro-invasiv måte, i sanntid, og in vivo, og repeterte målinger over tid i samme dyr ^2..

Foreløpig er dynamisk kontrastforsterket (DCE) avbildning ³ vanligvis brukes til å vurdere vev mikrosirkulasjonen. Dynamisk kontrastforsterket avbildning er en teknikk som følger over tid på biodistribusjonen av en tracer injiseres intravenøst. Fra dette oppkjøpet, kan kvantitative parametre hentes ut reflekterende vev vascularization. DCE bildebehandlinghar blitt oftest brukes med CT, MR eller ultralyd. Men disse avbildningsteknikker ikke tillater direkte visning av microvessels, siden deres oppløsning, annet enn ved bruk av spesifikke eksperimentelle enheter, forblir oftest makroskopisk.

I denne artikkelen foreslår vi å studere tumor blodkar på mikroskopisk skala og in vivo ved hjelp av dynamisk kontrast forbedret optisk bildebehandling, med fibered confocal videomicroscopy. Vi brukte et makromolekylært kontrastmiddel (FITC-dekstran) som forblir utelukkende innenfor fartøy eller lekkasjer gjennom endoteliale barrierer i interstitium, i henhold til molekylvekten og egenskapene til endotelet av vev undersøkt ^4.. Dette tillot studiet av både microvessel struktur, ved riktig opptegning fartøy, og kapillær permeabilitet, ved lekker og akkumuleres i interstitium.

Protocol

En. Utarbeidelse av kontrastmiddel For FITC-dekstran 70 kDa, er dosen injisert 500 mg / kg (10 mg av FITC-dekstran fortynnet i 0,1 ml saltløsning for en mus som veier 20 g). Midlet bør ikke utsettes for lenge for lys. For å unngå bleking, er det anbefalt å dekke røret med aluminiumsfolie. 2. Anestesi Mus ble bedøvd med en intraperitoneal injeksjon av en blanding av 01:04 av xylazin (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Frankrike) og ketamin (ketamin 500, Vi…

Representative Results

Ved hjelp av data samlet inn, kunne vi kvantitativt analysere ulike parametre som reflekterer mikrosirkulasjonen. Vi har studert in vivo på perifere vaskulære nettverk av et kolon tumor implantert i balb-c mus ved hjelp av en fibered confocal fluorescens videomicroscopy system (Cellvizio, Maunakea Technology, Paris, Frankrike 2), etter injeksjon av et makromolekylært fluorescerende kontrastmiddel Fluorescein isotiocyanat-dekstran ( FITC-dekstran) med en molekylvekt på…

Discussion

Studiet av svulst mikrosirkulasjonen har blitt viktig i forståelsen av patofysiologien av tumorvekst, formidling og respons på behandling ^en. Optisk avbildning er en av teknikkene som kan anvendes til å observere kapillarene ved hjelp av en fluoriserende kontrastmiddel og for å kvantifisere morfologisk (Functional Capillary Density) og funksjonelle (index lekkasje) parametere.

Fluorescens mikroskopi bildebehandling vi brukt i denne studien har både fordeler og begrensninger. …

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Insulin serynge Myjector 1ml 29G	Terumo Europe	BS-05M2913
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa	Sigma-Aldrich	01619HH	100 mg/mL diluted in saline
Fibered confocal videomicroscopy	Cellvizio – MaunaKea Technologies
Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000	Leica Microsystems	LSU-488	Store at 4 °C
Probe ProFlexTM Z	MaunaKea Technologies
Mosaicing software	MaunaKea Technologies
Vessel detection software	MaunaKea Technologies