В естественных изображений опухолевого ангиогенеза с помощью флуоресцентной конфокальной видеомикроскопии
Summary
В данной работе мы представляем метод для анализа опухолевых микрососудов в естественных условиях с использованием динамического контрастным усилением флуоресценции видеомикроскопии. Были приобретены два количественные параметры: функциональный плотности капилляров, отражающий кровоснабжение опухоли, и утечки индекс, отражающий неплотности из эндотелиальных стенках.
Abstract
Волокнистые конфокальной флуоресцентной в естественных изображений с светового пучка использует тот же принцип, как флуоресцентной конфокальной микроскопии. Это может возбудить флуоресцентные в элементах на места через оптические волокна, а затем записать некоторые из излучаемых фотонов, с помощью тех же оптических волокон. Источником света является лазер, который посылает возбуждающего света через элемент в расслоения и, как он сканирует по образцу, воссоздает изображения пиксель за пикселем. Как это сканирование происходит очень быстро, путем объединения его с выделенным программным обеспечением для обработки изображений, изображения в режиме реального времени с частотой 12 кадров / сек можно получить.
Мы разработали методику для количественного характеризуют капилляров морфологию и функцию, с помощью конфокальной флуоресцентной видеомикроскопии устройство. Первый шаг в нашем эксперименте было записывать 5 секунд фильмов в четырех квадрантов опухоли визуализировать капиллярную сеть. Все фильмы были обработаны с помощью программного обеспечения (яmageCell, Мауна-Кеа Технологии, Париж Франция), который выполняет автоматизированную сегментацию сосудов вокруг выбранного диаметра (10 мкм в нашем случае). Таким образом, можно количественно оценить "функциональной плотности капилляров ', который является соотношение между общей площадью сосуда и общей площади изображения. Этот параметр был суррогатным маркером плотности микрососудов, как правило, измеряется с помощью патологии инструменты.
Вторым шагом было записывать фильмы опухоли в течение 20 мин для количественного утечку макромолекулярном контрастного вещества через стенки капилляров в интерстиций. Измеряя соотношение интенсивности сигнала в интерстиции над, что в сосудах, был получен "индекс утечки", действуя в качестве суррогатного маркера проницаемости капилляров.
Introduction
Ангиогенез является сложным процессом, 1, что предполагает формирование новых кровеносных сосудов из уже существующих судов. Патологические изменения в ткани микроциркуляции, состоящие из артериол, капилляров и венул, вовлечены в большом спектре заболеваний, таких как рак, воспаление, или диабет. Поэтому очень важно в разработке методов количественной оценки структуры микрососудов и функции. Изображений позволяет изучать микрососудов в не-или микро-инвазивная образом, в режиме реального времени и в естественных условиях, и повторные измерения с течением времени в той же животного 2.
В настоящее время динамического контрастным усилением (DCE) визуализации 3 обычно используется для оценки тканевой микроциркуляции. Динамическая визуализация с контрастным усилением является методом, который следует в течение долгого времени биораспределение трассера введен внутривенно. С этим приобретением, количественные параметры могут быть извлечены отражающие ткани васкуляризации. Томография DCEбыл наиболее часто используется с КТ, МРТ или УЗИ. Однако эти методы визуализации не позволяют непосредственное наблюдение микрососудов, так как их разрешение, кроме с использованием конкретных экспериментальных устройств, наиболее часто остается макроскопическим.
В этой статье мы предлагаем изучить сосудистую сеть опухоли в микроскопическом масштабе и в естественных условиях с использованием динамического оптических изображений контрастным усилением, с расслаивается конфокальной видеомикроскопии. Мы использовали макромолекулярную контрастное вещество (FITC-декстран), который остается исключительно в судах или утечек через эндотелия барьер в интерстиции, в соответствии с его молекулярной массы и характеристики эндотелия ткани изучены 4. Это позволило изучение как структуры микрососудов, по правильно разграничения сосуды и проницаемость капилляров, по протекал, и накапливается в интерстиции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение опухоли микроциркуляции стало необходимым в понимании патофизиологии роста опухоли, распространения и реакции на лечение 1. Оптический изображений является одним из методов, которые могут быть использованы для наблюдения капилляры использованием флуоресцентного кон?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio – MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. . Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
