Imágenes in vivo de la angiogénesis tumoral usando fluorescencia confocal videomicroscopia
Summary
En este artículo se presenta un método para analizar los microvasos tumorales in vivo utilizando dinámica de fluorescencia videomicroscopy contraste. Dos parámetros cuantitativos se adquirieron: la densidad capilar funcional que refleja la vascularidad del tumor, y las fugas de índice que refleja la falta de estanqueidad de la pared endotelial.
Abstract
Con fibras de fluorescencia confocal de formación de imágenes in vivo con un haz de fibra óptica utiliza el mismo principio que la microscopía confocal fluorescente. Se puede excitar fluorescencia en elementos in situ a través de las fibras ópticas, y luego grabar algunos de los fotones emitidos, a través de las mismas fibras ópticas. La fuente de luz es un láser que envía la luz de excitación a través de un elemento dentro del haz de fibras y ya que revisa sobre la muestra, recrea una imagen píxel a píxel. Como este análisis es muy rápido, al combinarlo con el software de procesamiento de imágenes dedicado, imágenes en tiempo real con una frecuencia de 12 fotogramas / seg se pueden obtener.
Hemos desarrollado una técnica para caracterizar cuantitativamente la morfología y la función capilar, usando un dispositivo de videomicroscopía de fluorescencia confocal. El primer paso en nuestro experimento era grabar películas 5 segundos en los cuatro cuadrantes del tumor para visualizar la red capilar. Todas las películas fueron procesados mediante el software (ImageCell, Mauna Kea Tecnología, París Francia) que realiza una segmentación automatizado de los vasos alrededor de un diámetro elegido (10 micras en nuestro caso). Por lo tanto, se podría cuantificar la "densidad capilar funcional", que es la relación entre el área total del vaso y el área total de la imagen. Este parámetro fue un marcador sustituto para la densidad microvascular, por lo general medido usando herramientas de patología.
El segundo paso fue grabar películas del tumor durante 20 min para cuantificar la fuga del agente de contraste macromolecular a través de la pared capilar al intersticio. Mediante la medición de la relación de intensidad de la señal en el intersticio más que en los vasos, se obtuvo un "índice de fugas ', que actúa como un marcador sustituto para la permeabilidad capilar.
Introduction
La angiogénesis es un proceso complejo 1 que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes. Los cambios patológicos en la microcirculación del tejido, compuesto de las arteriolas, capilares y vénulas, están implicados en una amplia gama de enfermedades tales como el cáncer, la inflamación, o la diabetes. Por tanto, es esencial para desarrollar métodos para evaluar cuantitativamente la estructura y función de los microvasos. Imaging permite el estudio de los microvasos en un no-o de forma micro-invasivo, en tiempo real e in vivo, y medidas repetidas en el tiempo en el mismo animal 2.
Actualmente, con contraste dinámico (DCE) de formación de imágenes 3 es comúnmente utilizado para evaluar la microcirculación del tejido. De formación de imágenes de contraste mejorado dinámica es una técnica que sigue a lo largo del tiempo la biodistribución de un trazador inyectado por vía intravenosa. A partir de esta adquisición, parámetros cuantitativos se pueden extraer lo que refleja la vascularización del tejido. Imágenes DCEse ha utilizado con mayor frecuencia con la TC, resonancia magnética o ecografía. Sin embargo, estas técnicas de imagen no permiten la visión directa de los microvasos, ya que su resolución, que no sea con el uso de dispositivos experimentales específicos, más a menudo permanece macroscópica.
En este trabajo, nos proponemos estudiar la vascularización del tumor a escala microscópica como in vivo utilizando imágenes ópticas con contraste dinámico, con Fibered videomicroscopy confocal. Se utilizó un agente de contraste macromolecular (FITC-dextrano) que permanece exclusivamente dentro de los vasos o las fugas a través de la barrera endotelial en el intersticio, de acuerdo con su peso molecular y las características del endotelio del tejido estudiaron 4. Esto permitió que el estudio de la estructura tanto de los microvasos, delineando correctamente los vasos, y la permeabilidad capilar, filtrando y acumulando en el intersticio.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio de la microcirculación tumoral se ha convertido en esencial en la comprensión de la fisiopatología del crecimiento del tumor, diseminación y respuesta al tratamiento 1. De formación de imágenes óptico es una de las técnicas que se pueden utilizar para observar los capilares usando un agente de contraste fluorescente y para cuantificar morfológica (densidad capilar funcional) y los parámetros (índice de fuga) funcionales.
La imágenes de microscopía de fluore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio – MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
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