재조합 핵심 히스톤에서 뉴 클레오 배열과 뉴 클레오 솜 위치 DNA의 조립

요약

방법은 재조합 핵심 히스톤에서 모델 뉴 클레오 어레이의 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에 표시됩니다. 또한 분석에서 초 원심 침강 속도 실험, 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 재구성 후의 뉴 클레오 배열 포화 정도를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

초록

반복적 DNA 분자를 따라 간격이 핵심 히스톤 octamers는 뉴 클레오 배열이라고합니다. 뉴 클레오 배열은 두 가지 방법 중 하나를 얻을 수있다 : 생체 소스의 정제, 또는 재조합 핵심 히스톤에서 체외에서 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA. 후자의 방법은보다 구조적으로 균일 한 조립 및 정밀 위치 뉴 클레오 배열을 허용하는 이점을 갖고있다. 그들이 원심력 하에서 용액을 통해 이주하는 비율을 분석함으로써 고분자의 크기 및 형상에 대한 분석 초 원심 수율 정보에 침강 속도 실험. 이 기술은, 원자력 현미경과 함께 DNA 템플릿의 대다수는 재구성 후 뉴 클레오로 포화되는 것을 보장하는, 품질 관리에 사용될 수있다. 여기에서 우리는 길이 밀리그램 수량을 재구성 할 필요가 조성이 D 프로토콜을 설명염색질의 구조와 기능의 생화학 및 생물 물리학 연구에 적합한 efined 뉴 클레오 배열.

서론

진핵 생물의 게놈은 벌거 벗은 DNA가 존재하지 않고, 압축 및 결합 단백질에 의해 구성됩니다. DNA와 단백질의이 단지는 염색질로 알려져 있습니다. 염색질의 기본 반복 단위는 뉴 클레오입니다. 뉴 클레오 히스톤 옥타 약 1.6 배 ¹ 옥타 머 히스톤 주위에 감싸 인 DNA의 146 개의 염기쌍으로 구성되어 있습니다. 히스톤 옥타는 두 개의 복사본 핵심 히스톤의 H2A, H2B, H3, H4와 각각 구성되어있다. 반복적 DNA 분자를 따라 간격이 핵심 히스톤 octamers는 뉴 클레오 배열이라고합니다. 뉴 클레오 배열의 확장 구조는 구조 "문자열에 구슬"10 나노 섬유 또는로하고, 저 염분의 조건 ^2에서 체외에 존재하고있다. 10 ㎚ 섬유는 배열 내부 압축 및 / 또는 인터 - 배열 올리고머 ^(2)를 통해 고차 구조로 집광 할 수있다. 이러한 고차 구조, 염의 존재하에 유발 될 수있다또는 뉴 클레오 배열 ^3,4에 염색질 건축 단백질의 결합을 통해 영향을받을 수있다. 염색질 압축의 수준은 반비례 생체 ^5,6의 전사 율과 상관된다. 최근의 연구는 분화, 암 발생 및 기타 ^7,8 같은 공정에서 게놈의 조직 구조의 중요성을 강조한다. 염색질의 구조....

프로토콜

1. Octamers 재조합 핵심 히스톤의 조립

이유 : 뉴 클레오 어레이 재구성의 첫 번째 단계는 동결 건조 된 재조합 코어 히스톤으로부터 네이티브 코어 히스톤 octamers을 제조하는 공정이다. 히스톤 단백질은 동일한 몰 양의 결합 버퍼를 재 접힘에 변성 버퍼 중 샘플을 투석에 의해 히스톤 octamers로 조립된다.

1. 정화 ^(13)을 설명 된대로 (H2A, H2B, H3, H4) 재조합 핵심 히스톤을 냉동 건조.
2. 전개 버퍼 (6 M 구 아니 염산, 20 MM 트리스 산도 7.5, 5 mM의 DTT)의 3 ㎖에 각 동결 건조의 핵심 히스톤의 약 5 밀리그램을 녹입니다. 각 나누어지는 적어도 한 시간 동안 분해 할 수 있습니다. 어떤 단백질이 용기의 측면에 남아 있는지 확인합니다.
3. 참고로 전개 버퍼를 사용하여 276 nm에서 각 히스톤의 흡광도를 측정한다.
4. 그들의 흡광 계수를 사용하여 각 히스톤의 몰 농도를 계산한다 (표 1 참조 Xenopus의 히스톤 흡광 계수의 경우). 단백질의 대부분이 용해되면 동결 건조 중량 및 추정에 히스톤의 흡광도 결정된 농도를 비교한다.
5. 이....

결과

프로토콜을 설명하기 위해 우리는 12 직렬의 601 위치 시퀀스 (601 ²⁰⁷ × 12)의 207 bp의 반복으로 이루어진 재조합 Xenopus의 핵심 히스톤과 DNA에서 뉴 클레오 배열을 재구성. 우리는 먼저 동결 건조의 핵심 히스톤에서 네이티브 octamers을 조립 한 후 S200 열 (그림 1A)를 사용하여 FPLC에 의해 octamers을 정제. 큰 단지는 S200 열에서 이전 용출. 히스톤은 일반적으로 다음 순서로 용출 : 비 특이 히스톤 집계, 히스톤 옥타 머, H3/H4 량체 및 H2A/H2B 이합체 (그림 1A). S200 열에서 피크를 SDS-PAGE에 의해 분석 하였다. 정제 된 옥타 머 분획의 겔은 네 히스톤 단백질 (도 1b)의 몰량을 표시한다. Xenopus의 H2A와 H2B는 약 200 다에 따라 다릅니다 따라서 그들은 SDS 겔에 하나의 밴드로 표시 분자량.......

토론

모델 뉴 클레오 어레이는 염색질 구조와 기능의 시험 관내 연구에 매우 유용한 도구이다. 예를 들어, 널리 용액 ^30-34에서 염색질 섬유 축합 메카니즘을 연구하는 데 사용하고, 그것이 가능 tetranucleosome ^(35)의 x-선 구조를 구하는되었습니다. 최근에 그들은 특정 핵심 히스톤 변형, 돌연변이 전사 후 수정 ^14-16,36의 구조적 효과를 해독에 유용 입증했다. 여기에서 우리는 뉴 클레오 솜 위치 DNA 재조합 핵심 히스톤에서 모델 뉴 클레오 배열의 어셈블리에 대한 일반적인 방법을 설명합니다.

정제 octamers 601 ²⁰⁷ X 12 DNA에서 뉴 클레오 배열의 재구성은 순차적으로 2 M 2.5 밀리미터에서의 NaCl 농도를 낮추는 여러 가지 투석 단계를 포함하는, 간단합니다. 프로토콜의 가장 어려운 부분은 원하는 TEM을 산출 r 값을 사용하는 것이다판 포화 수준.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(3-아미노프로필)트리에톡시실란	시그마-알드리치	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO 투석 튜빙	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 열	GE	17-1069-01
Vivaspin, 50 kDa MWCO 원심 농축기	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO 투석 튜빙	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I 분석용 초원심분리기	Beckman-Coulter