Vivo सी. में neuronal कैल्शियम इमेजिंग में एलिगेंस
Summary
अपने छोटे पारदर्शी शरीर, neuroanatomy अच्छी तरह से प्रलेखित और उत्तरदायी आनुवंशिक तकनीक और अभिकर्मकों के एक मेजबान के साथ,<em> सी. एलिगेंस</em> के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बनाता है<em> Vivo में</em> Neuronal अपेक्षाकृत सरल, कम लागत वाली तकनीक का उपयोग इमेजिंग. यहाँ हम बरकरार वयस्क आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतकों का उपयोग जानवरों के के भीतर एक न्यूरॉन इमेजिंग का वर्णन.
Abstract
निमेटोड कीड़ा सी. एलिगेंस अपेक्षाकृत सरल है, vivo में कम लागत neuronal इमेजिंग के लिए एक आदर्श मॉडल जीव है. अपने छोटे पारदर्शी शरीर और सरल, अच्छी तरह से विशेषता तंत्रिका तंत्र और बरकरार पशु के भीतर किसी भी न्यूरॉन के प्रतिदीप्ति इमेजिंग की पहचान की अनुमति देता है. पशु शरीर क्रिया विज्ञान पर न्यूनतम प्रभाव के साथ सरल स्थिरीकरण तकनीक विस्तारित समय चूक इमेजिंग की अनुमति देते हैं. cameleon 1 और 2 GCaMP के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संवेदनशील fluorophores के विकास neuronal दोनों सेल फिजियोलॉजी और neuronal गतिविधि से संबंधित कैल्शियम के vivo इमेजिंग में अनुमति देते हैं. कई ट्रांसजेनिक विशिष्ट न्यूरॉन्स में इन fluorophores व्यक्त उपभेदों आसानी से उपलब्ध हैं या अच्छी तरह से स्थापित तकनीक का उपयोग करते हुए निर्माण किया जा सकता है. यहाँ, हम vivo में एक न्यूरॉन का उपयोग दोनों GCaMP और cameleon के भीतर कैल्शियम गतिशीलता को मापने के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है. हम फायदे और disadvant पर चर्चादोनों की उम्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूना (जानवर स्थिरीकरण) तैयार करने और छवि विश्लेषण के विभिन्न तरीकों. अंत में, हम दो प्रयोगों से परिणाम वर्तमान: 1) GCaMP का उपयोग करने के लिए एक बाहरी बिजली के क्षेत्र और 2 के लिए एक विशिष्ट न्यूरॉन के संवेदी प्रतिक्रिया) cameleon का उपयोग करने के लिए दर्दनाक लेजर क्षति के लिए एक न्यूरॉन के शारीरिक कैल्शियम प्रतिक्रिया को मापने को मापने. इस तरह के रूप में इन कैल्शियम इमेजिंग तकनीक सी. में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है एलिगेंस और आज़ादी से चलती जानवरों, एक साथ एकाधिक न्यूरॉन्स और तुलना में किया गया है आनुवंशिक पृष्ठभूमि भर माप सी. बढ़ाया. एलिगेंस लिए अन्य मॉडल सिस्टम पर तकनीकी सादगी और लागत में लाभ के साथ vivo neuronal इमेजिंग में एक मजबूत और लचीली प्रणाली प्रस्तुत करता है.
Introduction
यहाँ हम सी. में vivo कैल्शियम इमेजिंग में वर्तमान के लिए व्यावहारिक तरीके एलिगेंस न्यूरॉन्स. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम के प्रति संवेदनशील fluorophores के उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ विकास सी. बनाता है neurophysiology और गतिविधि की माप के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी प्रणाली एलिगेंस. हमारी इमेजिंग आमतौर पर उपलब्ध fluorophores के व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग एक मानक यौगिक खुर्दबीन के साथ किया जाता है. हम कई विभिन्न fluorophores और अलग नमूना तैयारी रोजगार तकनीक मौजूद है, और प्रत्येक की ताकत और कमजोरी पर चर्चा. डाटा तो दो उदाहरण प्रयोगों से प्रस्तुत किया है. यहाँ वर्णित तकनीकों पर एक उत्कृष्ट अतिरिक्त संसाधन, आर Kerr द्वारा "न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की गतिविधि इमेजिंग" (WormBook में पाया जा सकता http://www.wormbook.org 3).
Geneti के दो प्रमुख वर्गोंबड़ी सफाई encoded फ्लोरोसेंट कैल्शियम संवाददाताओं से सामान्यतः सी. में उपयोग किया जाता है एलिगेंस एकल चैनल GCaMP और झल्लाहट आधारित cameleon:. हम विधियों का वर्णन और प्रत्येक के द्वारा उत्पन्न डेटा के लिए उदाहरण दिखा देंगे.
GCaMP एक संशोधित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) कि आसपास के कैल्शियम एकाग्रता के प्रति संवेदनशील है पर आधारित है. यह GFP की विलय और उच्च कैल्शियम आत्मीयता प्रोटीन calmodulin, जैसे कि कैल्शियम की calmodulin से बाध्यकारी एक कुशल फ्लोरोसेंट 2 पुष्टि GFP अणु में लाता है के द्वारा पूरा किया है. इन fluorophores में हाल ही में प्रगति प्रतिदीप्ति तीव्रता में कैल्शियम का स्तर एक शारीरिक श्रृंखला और ~ 95 मिसे वृद्धि समय और ~ 650 मिसे क्षय 4 समय के काफी तेजी से कैनेटीक्स पर 500% अप करने के लिए वृद्धि के साथ असाधारण संकेत आकार उत्पन्न करते हैं. अपेक्षाकृत कम समय अवधि (मिनट), इन बड़े संकेत कम संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति (कम वृद्धि) और कर सकते हैं, एक init अच्छी तरह से व्यवहारial आधारभूत माप, निरंतर आधारभूत या तुलनात्मक माप के लिए आवश्यकता नकारना.
Cameleon एक fluorophore झल्लाहट आधारित है कि एक ratiometric दो स्वतंत्र चैनल या 1 तरंगदैर्य की तुलना माप उत्पन्न होने का फायदा है. यह दो अलग (सियान और पीले उत्सर्जन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, CFP और YFP) fluorophores एक calmodulin प्रोटीन से जुड़े हुए होते हैं. जटिल नीले प्रकाश (440 एनएम) कि CFP उत्तेजित के साथ प्रबुद्ध है. कैल्शियम की बाइंडिंग fluorophores करीब एक साथ लाता है, CFP (दाता) से प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) बढ़ती YFP (स्वीकर्ता) और CFP उत्सर्जन (480 एनएम) में कमी करने के लिए और YFP उत्सर्जन (535 एनएम) को बढ़ाने के कारण . रिश्तेदार कैल्शियम का स्तर YFP / CFP तीव्रता के अनुपात के रूप में मापा जाता है. Cameleon कैनेटीक्स GCaMP, vivo में मापा ~ 1 सेकंड की वृद्धि समय और ~ 3 5 सेकंड के एक क्षय समय की तुलना में धीमी गति से कर रहे हैं. हालांकि,oppositely आगे बढ़ संकेतों के संकेत अनुपात का आकार बढ़ता है और fluorophore एकाग्रता, गति, या फोकस बहाव और विरंजन में परिवर्तन की वजह से संभव कलाकृतियों की एक संख्या के लिए compensates.
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट पत्रकारों से नमूना exogenously प्रशासित जांच और सी. के साथ आवश्यक तैयारी की बहुत नकारना एलिगेंस छोटे पारदर्शी शरीर बरकरार सरल प्रतिदीप्ति व्यापक क्षेत्र का उपयोग पशु भीतर इमेजिंग की अनुमति देता है. नमूना तैयार करने में मुख्य तकनीकी चुनौती है इसलिए जानवरों के लिए सुरक्षित रूप से स्थिर है. वहाँ अलग फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक आमतौर पर इस्तेमाल किया तकनीकों का एक नंबर रहे हैं. जानवरों को पंगु बना एक औषधीय एजेंट का प्रयोग को लागू करने के लिए आसान है और एक तैयारी पर कई जानवरों के बढ़ते (levamisole, एक cholinergic agonist है कि मांसपेशियों के ऊतकों को जब्त करने का कारण बनता है आम तौर पर प्रयोग किया जाता 6) की अनुमति देता है सी.. एलिगेंस भी शारीरिक रूप से उन्हें बढ़ते द्वारा स्थिर हो सकता हैकड़ी 10% agarose 7, 8 पर. पशु शरीर क्रिया विज्ञान पर यह कम से कम प्रभाव है, लंबी अवधि के इमेजिंग (घंटे) और कई जानवरों की वसूली की अनुमति देता है, लेकिन और अधिक तकनीकी रूप से कठिन है. इन तकनीकों के दोनों जानवरों (जो एक कवर पर्ची के तहत कर रहे हैं) के लिए शारीरिक का उपयोग सीमित है और इसलिए केवल कुछ प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं (जैसे प्रकाश, तापमान, बिजली के क्षेत्र में या लेजर क्षति के रूप में) के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. या रसायनों के संपर्क प्रशासन के रूप में जहां शारीरिक का उपयोग की आवश्यकता है उत्तेजनाओं के लिए, कई अध्ययनों सफलतापूर्वक सी. चिपके हैं जगह में एलिगेंस (पशु चिकित्सा ग्रेड गोंद का उपयोग कर) 9. यह तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण है, एक एकल पशु तैयारी है और जानवर वसूली की अनुमति नहीं है. अंत में, कई microfluidic उपकरणों नियोजित किया गया है कि शारीरिक रूप से सी. को नियंत्रित एलिगेंस, पशु शरीर क्रिया विज्ञान के संरक्षण, उत्तेजनाओं (डिवाइस डिजाइन पर निर्भर करता है) के सबसे प्रकार के लिए जोखिम की अनुमति सक्षम कर सकते हैं और तेजी से और पशुओं की विनिमय वसूली <sup> 10, 11. हालांकि microfluidics डिजाइन, निर्माण और कार्यान्वयन में अतिरिक्त तकनीकी कौशल और क्षमताओं की आवश्यकता है. Immobilized जानवरों गतिविधि और उत्तेजना में प्रतिक्रिया आम तौर पर संवेदी और interneurons में मापा जा सकता है. मोटर न्यूरॉन्स की गतिविधि चलती जानवरों में इमेजिंग के लिए और अधिक परिष्कृत तकनीक की आवश्यकता है. यहाँ हम विस्तृत औषधीय paralyzation और कड़ी agarose साथ स्थिरीकरण के दो सबसे सरल तकनीकों को रोजगार तरीकों को पेश करेंगे.
यहाँ प्रस्तुत तरीकों neuronal और सी. में सेल फिजियोलॉजी गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एलिगेंस. हम प्रत्येक का एक उदाहरण दे: GCaMP का उपयोग करने के लिए एक बाहरी बिजली क्षेत्र के लिए ASJ न्यूरॉन का संवेदी प्रतिक्रिया को मापने, और cameleon का उपयोग करने के लिए शारीरिक कैल्शियम एक न्यूरॉन के लेजर क्षति प्रतिक्रिया उपाय. इन उदाहरणों fluorophores के लिए दो प्रकार के लाभ और कमियां दिखाने के लिए और वर्णन क्या प्रणाली के साथ संभव है.
Protocol
Representative Results
Discussion
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों को व्यापक रूप से किया गया है सी. में उपयोग एलिगेंस neurobiology. कई समूहों इन तकनीकों कार्यरत है प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के बाहरी उत्तेजनाओं को जवाब का अध्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कई लोगों ने इस पत्र में वर्णित काम करने के लिए योगदान दिया. CVG प्रयोगात्मक सेटअप बनाया, और रास, SHC, और CVG प्रयोगों का प्रदर्शन किया. CVG और SHC पांडुलिपि लिखा था. सभी लेखकों बाद में संशोधन की प्रक्रिया में भाग लिया और पांडुलिपि के अंतिम प्रतिलिपि को मंजूरी दे दी है. हम GCaMP तनाव के लिए पॉल स्टर्नबर्ग धन्यवाद. कुछ निमेटोड इस काम में इस्तेमाल उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स (CGC) केंद्र है, जो अनुसंधान संसाधन के लिए NIH राष्ट्रीय केंद्र (NCRR) द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान किया गया. MATLAB छवि विश्लेषण कार्यक्रम 18 में इस्तेमाल किया है कि से अनुकूलित किया गया था. लेखक बोस्टन विश्वविद्यालय और मैसाचुसेट्स जीवन विज्ञान केंद्र द्वारा समर्थित थे.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
